青霉素菌渣堆肥农用土壤中抗生素抗性基因的污染特征及扩散机制研究

Antibiotic residues discharged into the environment will lead to kinds of environmental problems related to the drug-resistant bacteria and their resistance genes (ARGs). Composting is considered to be an efficient and harmless disposal for this kind of residues, while at this stage, the study on the environmental impact of antibiotic residue compost applied in soil is still lacking. Therefore, this project intends to take Penicillin Fermentation Fungi Residue (PFFR) as an example by using composting system. The penicillin degradation kinetic model will be established through the dynamic response of penicillin and its resistance genes under different conditions during composting, in order to identify the key controlling environmental factors, optimizing composting process; by using high through-put quantitative PCR and Illumina Miseq sequencing approach, we aim also to, (1) examine the types and abundances of ARGs and mobile genetic elements (MGEs) in PFFR compost-amended soil; (2) investigate the bacterial community composition and diversity in PFFR compost-amended soil; (3) assess the persistence of ARGs in manure-amended soil by analyzing the abundance of ARGs at different time after compost application and the distribution of ARGs in soil. By comparing the genetic diversity of ARGs and MGEs, and bacterial community, and statistical analysis of correlation with environmental factors, we will try to elucidate the characterization of contamination and dissemination of ARGs in PFFR compost-amended soil, and provide a scientific basis for the ARGs contamination in farmland soil.

抗生素菌渣排入环境会引发抗药性细菌及其抗性基因（ARGs）的环境问题，堆肥被视为是一种对菌渣高效且无害化处理方式，但是现阶段仍然缺乏菌渣堆肥施用于土壤后对环境影响的深入研究。本项目拟以青霉素菌渣为对象，构建堆肥体系，针对不同条件菌渣堆肥下青霉素及其抗性基因的动态响应，识别关键因子，优化堆肥过程，筛选最优堆肥条件；采用高通量定量PCR技术探讨菌渣堆肥施用土壤中ARGs和基因水平转移元件的丰度和分布；采用Illumina Miseq测序手段揭示菌渣堆肥对土壤中微生物群落结构的影响；通过分析施加肥后不同时间点土壤中ARGs的丰度及其分布，探究ARGs在农田土壤中的持续性。进一步从ARGs丰度、微生物群落结构、基因水平转移机制等方面，同时结合环境因子进行统计分析，全面系统地阐释农田土壤ARGs的污染特征及扩散机制，为探明施用青霉素菌渣堆肥对农田土壤中ARGs污染提供科学依据。

本研究以青霉素制药污泥堆肥化为基础研究，同时进一步研究了施用不同污泥肥料对土壤及作物根和叶表中ARGs多样性和丰度的影响,为青霉素制药污泥资源化利用提供理论基础。主要研究结果概括如下：.（1）以制药污泥为研究对象，采用葡萄糖、蔗糖、玉米秸秆粉及其混合物作为外加碳源和添加竹炭，研究不同类型的外加碳源及竹炭对堆肥系统一次发酵周期内温度、有机质等理化参数变化及青霉素的降解情况的影响。结果表明，堆体中有机质含量与外加碳源的量呈正比，堆体中有机质的质量分数随堆肥时间不断下降且趋于稳定。温度是青霉素降解的主要影响因素。外加碳源增加了堆体溶解性有机质质量分数，生物可利用碳源的增加促进了堆肥过程中微生物的转化作用，并有助于提高堆肥过程温度。.（2）基于实时荧光定量PCR的方法，对堆肥过程中各阶段堆肥样品中β-内酰胺类抗性基因（bla-CTX-M-1、bla-CMY、bla-OXA-23、bla-TEM、bla-NDM-1和blaCEP-02基因）进行定性和绝对定量，初步探讨制药污泥堆肥过程中β-内酰胺类抗性基因（bla-CTX-M-1、bla-CMY、bla-OXA-23、bla-TEM、bla-NDM-1和blaCEP-02基因）的数量变化。研究发现，高温好氧堆肥对β-内酰胺类抗性基因（bla-TEM、bla-NDM-1和blaCEP-02 基因）数量有一定的消减作用，但是对于堆肥过程中ARGs的多样性和堆肥条件的控制仍需进一步研究。.（3）通过室内盆栽实验研究了施用污泥肥料对青菜非根际土、根际土以及作物根和叶表面 ARGs 的影响。结果表明，制药污泥肥料的施用提高了土壤-上海青系统内ARGs的多样性和归一化丰度。Mantel test和Procrustes test的分析揭示了ARGs谱系与微生物群落（真菌和细菌）之间的联系。在上海青叶际、根以及根际土中发现了共享的ARGs，证明上海青中的抗生素抗性基因和土壤之间存在潜在的联系，经过制药污泥肥料施用后的土壤是上海青根际中ARGs的主要来源。综上所述，我们的发现为ARG在制药污泥施用的土壤-绿色蔬菜系统中通过共享的零半径操作分类单元(ZOTUs)和ARGs传播提供了新的证据，强调了抗生素抗性从土壤转移到人类食物链的潜在安全隐患。