线粒体解偶联蛋白2介导心脏低温保存损伤及其机制研究

Heart transplantation has become an established treatment for patients with end-stage heart failure. The success of heart transplantation is critically dependent on the quality of the donor heart. Hypothermic preservation-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis are the two key factors that limit the heart preservation time and efficiency. Uncoupling protein 2 (UCP2) is a key mitochondrial protein that regulates the energy metabolism and cardiomyocyte apoptosis. Our primarily study showed that hypothermic preservation could cause the increase in UCP2 protein expression in a time-dependent manner. But the pros and cons of overexpression of UCP2 protein in preserved heart in still unclear. The aims of present study are to elucidate whether the overexpression of UCP2 is a cause or an effect in the hypothermic preservation-induced apoptosis by injection of fusion protein and using siRNA interference technology; to determine whether the mechanism of UCP2 induced myocardium injury is mainly due to reduction in ATP synthesis. This study would also investigate whether the molecular mechanism of UCP2-induced apoptosis is involved in the opening of mitochondrial permeability transition pore and upregulation of pro-apoptotic protein. This study may help to provide a new target for the clinical research on improvement of the donor heart function, at last to service clinical heart transplantation, and to save more patients with end-stage heart failure.

有效地维持线粒体的正常功能，减少内源性细胞凋亡的发生，是提高供心长时程低温保存时效的关键。解偶联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）是调控心肌能量代谢和细胞凋亡的关键性线粒体蛋白。我们的预实验发现，大鼠心脏低温保存后，UCP2表达随保存时间的延长逐渐增加，但UCP2过表达是利还是弊还不明了。本课题将利用注射融合蛋白的方法和siRNA干扰技术研究UCP2过表达或沉默对低温保存诱导的心肌凋亡的影响，明确在长时间心脏低温保存过程中，UCP2过表达是一种损伤机制还是适应性反应；探讨UCP2抑制线粒体ROS生成和减少ATP合成的双重功能在低温保存中哪种占主导地位。并进一步在细胞水平，利用基因转染技术阐明UCP2过表达促进心肌细胞凋亡的下游分子机制。本课题的研究将为临床上供心保存效果的研究提供新的药物作用靶点，最终服务于临床心脏移植技术，挽救更多的终末期心脏病患。

有效地维持线粒体的正常功能，减少内源性细胞凋亡的发生，是提高供心长时程低温保存时效的关键。解偶联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）是调控心肌能量代谢和细胞凋亡的关键性线粒体蛋白。本课题的主要目的：明确UCP2表达增加确实参与了低温保存心脏凋亡损伤的发生；并阐明UCP2过表达诱导心肌细胞凋亡、参与细胞信号通路调节的分子作用机制。.本课题采用离体心脏Langendoff灌流模型，观察大鼠心脏于Celsior低温保存后心脏收缩功能改变。观察H9c2细胞生存率和凋亡发生率。WB法检测UCP2、CX43、Bid蛋白表达情况。比色法测定ROS和ATP水平、以及MPT孔开放程度。研究发现：（a）大鼠心脏低温保存3、6、9 h后复灌60min后，在复灌期心功能明显下降，细胞凋亡数增加。UCP2表达增加与细胞凋亡呈正相关。（b）在冷保存液中添加UCP2抑制剂genipin，可减轻低温保存心脏的凋亡发生，改善心功能。冷保存液中添加genipin后，细胞ATP的产生量明显增加，细胞线粒体钙超载的量明显减少，但对细胞ROS的产生量并无明显影响。（c）冷保存心肌细胞CX43磷酸化水平下降，且其线粒体组分也明显下降。Genipin可使CX43磷酸化水平和线粒体组分明显增高。（d）心肌细胞冷保存后，MPT孔开放程度增加，Bid裂解后产生的tBid片段量显著增加。UCP2抑制剂可部分取消冷保存诱导的MPT孔开放，减少冷保存诱导的tBid片段量。MPT孔的开放剂苍术苷虽然不能改变冷保存诱导的tBid片段量增加，但可以部分取消UCP2抑制剂genipin对抗冷保存诱导的细胞凋亡增加和生存率降低。.以上结果提示，心脏冷保存后复灌期心功能的下降可能与线粒体UCP2表达增加有关，UCP2增加所导致的ATP合成减少可能是心肌细胞损伤的主要原因。其机制可能与促进MPT孔开放，增加凋亡蛋白Bid的裂解，促进心肌细胞凋亡有关。本课题的研究将为临床上供心保存效果的研究提供新的药物作用靶点，最终服务于临床心脏移植技术，挽救更多的终末期心脏病患。