Cx43线粒体转位对低温保存心脏的保护作用和分子机制研究

减轻供心低温保存损伤是心脏移植成功的前提，供心在低温保存期间细胞凋亡的发生是制约心脏保存时限的主要因素之一。连接蛋白43（Cx43）是心肌细胞最主要的一种缝隙连接蛋白，近来的研究表明Cx43不仅存在于细胞质膜上还存在于线粒体膜上（mitoCx43），并参与细胞生存的调节。mitoKATP通道开放剂二氮嗪可引起Cx43转位到线粒体，对抗低温保存诱导的心肌细胞凋亡，但机制尚不清楚。本课题将采用DNA定点突变的方法，明确参与Cx43转位至线粒体膜的关键磷酸化位点；同时利用注射融合蛋白的方法研究mitoCx43表达增加对低温保存心脏的作用，进行实验性治疗；进一步利用酵母双杂交系统筛选和鉴定与mitoCx43相互作用的凋亡相关蛋白。通过本课题的研究将阐明mitoCx43转位对心脏低温保存的分子作用机制，从而为临床上心肌保护药物的研究提供新的药物作用靶点。

减轻供心低温保存损伤是心脏移植成功的前提，供心在低温保存期间细胞凋亡的发生是制约心脏保存时限的主要因素之一。近年来研究表明，Cx43不仅存在于心肌细胞质膜上，也存在于心肌细胞线粒体上（mitoCx43），并参与细胞生存的调节。本课题旨在研究mitoCx43转位是否介导了mitoKATP通道开放剂诱导的心肌保护作用，明确参与Cx43线粒体转位的关键磷酸化位点，阐明mitoCx43表达增加对抗心肌细胞凋亡的下游分子机制。研究结果表明：（1）在Celsior心脏保存液中添加mitoKATP通道的开放剂二氮嗪，能延长心脏保存时间，减轻供心长时间低温后心功能的下降，并减少细胞凋亡的发生，抑制促凋亡分子Bid蛋白裂解。（2）与9h低温保存组心脏相比，在保存液中添加二氮嗪后，Hsp90 mRNA与蛋白表达水平提高，总Cx43和mitoCx43表达亦明显增高。Hsp90的抑制剂17-AAG对二氮嗪引起的低温保存心脏总Cx43蛋白表达增加无明显影响，但可显著抑制mitoCx43的转位。17-AAG同时也部分取消了二氮嗪的心肌保护作用。（3）与单纯低温保存组相比，过表达Cx43蛋白的H9c2细胞低温保存后存活率显著增高，LDH含量显著下降；S262A突变取消Cx43蛋白过表达对冷保存细胞的保护作用；而过表达Cx43的H9c2细胞对抗冷保存损伤作用与缝隙连接的形成无关。（4）细胞过表达mitoCx43后，心肌细胞中的Bcl-2/Bax比例增加。通过多序列比对发现，Cx43蛋白含有与Bcl-2家族蛋白类似的BH3结构域。免疫共沉淀实验结果表明在心肌细胞内Cx43和Bcl-2可以形成复合体。提示mitoCx43可能通过BH3结构域直接与Bcl-2结合，从而抑制了低温保存诱导的细胞凋亡的发生。本课题的意义在于通过阐明mitoCx43转位对心脏低温保存的分子作用及其机制，为临床上心肌保护药物的研究提供新的药物作用靶点。