基于线粒体功能调控研究PM20D1在高脂饮食致胰岛素抵抗中的作用及机制

Disorder of energy metabolism is an important reason to induce obesity and related diseases. N-Lipid Amino Acids(N-LAA) are UCP1-independent mitochondrial uncouplers, which can dissipate chemical energy as heat to keep energy balance. Our team has proved previously that PM20D1 shows strong activity to catalyze the hydrolytic reaction of N-LAA by constructing recombinant PM20D1 secreted enzyme, and PM20D1 overexpression would enhance the insulin resistance induced by High Fat Diet(HFD). As a result, we speculate that PM20D1 overexpression will decrease energy expenditure and augment insulin resistance by catalysing the hydrolytic reaction of N-LAA, but PM20D1 knock-down will be helpful to improving glucose homeostasis and increases energy expenditure. To verify the hypothesis, we plan to construct catalytic reaction of PM20D1 in molecule level to compare its synthetic activity and hydrolytic activity. At the same time, we will construct recombinant plasmid to overexpress PM20D1, then explore its effect on cell energy metabolism by transfected the plasmid into C2C12 cell. Lastly, we will explore the effect of PM20D1 in regulating both energy metabolism and glucose level of mice by AAV-overexpression and knock-down of PM20D1 using CRISPR/Cas9 technology. The research will find new support for the relationship between obesity and diabetes form the angle of energy metabolism, new target and theoretical basis for drug discovery as well.

能量代谢障碍是导致肥胖及相关疾病的重要原因。N-脂质氨基酸(N-LAA)是独立于解偶联蛋白(UCP1)的新型线粒体解偶联剂，可将化学能以热量消耗，从而维持能量平衡。前期，本课题组通过重组PM20D1分泌酶，体外证明其对N-LAA有强催化分解作用；小鼠过表达PM20D1会增强高脂诱导的胰岛素抵抗。由此，我们推测PM20D1通过催化分解N-LAA引起能量平衡失调，导致胰岛素抵抗，而PM20D1低表达有利于消耗能量及维持血糖平衡。为验证此假设，本课题拟在分子水平建立PM20D1催化反应体系，进一步评价其催化能力。同时，构建PM20D1表达质粒，通过转染C2C12细胞探索其对细胞能量代谢的影响。利用腺相关病毒过表达PM20D1及CRISPR/Cas9敲除小鼠PM20D1，探究其对小鼠能量代谢及血糖的调控作用。以期从能量代谢角度为揭示肥胖及糖尿病的关系提供新依据，为研发新药提供新靶点和理论基础。

PM20D1作为分泌酶可以催化脂肪酸与氨基酸合成N--酰基氨基酸（N-AAA），同时也可将N-AAA催化分解为脂肪酸和氨基酸。尽管在小鼠体内过表达PM20D1可以增加能量消耗以对抗高脂饮食导致的肥胖，但相关临床研究未见报道。同时，以往的PM20D1基因过表达研究与基因敲除研究结果相互矛盾，表明PM20D1在能量代谢中的调节作用需进一步确证。因此，本课题着眼于：1）探索血液中PM20D1及N-AAA与肥胖相关代谢指标的临床关联性；2）对比PM20D1在不同环境温度下对疾病小鼠的药理作用；3）揭示PM20D1基于锌离子结合特性作为代谢感受器的潜在机制。. 本项目采用免疫试剂盒和液-质联用仪检测了256人（78个健康人，178个超重/肥胖病人）血液中PM20D1、油酸及两种主要的N-AAA（C18:1-Leu和C18:1-Phe）含量，并评估了磺酰脲类降糖药和罗格列酮对血液PM20D1及其代谢物含量的影响。同时，建立了重组腺相关病毒PM20D1过表达系统，监测正常与肥胖小鼠在不同环境温度下的代谢表型、血液C18:1、C18:1-Leu、C18:1-Phe及锌离子的含量。最后，体外验证了PM20D1的锌离子结合特性及锌离子对PM20D1合成及分解活性的影响。. 本项目临床研究发现，与健康人相比，超重/肥胖病人血液PM20D1含量显著升高，并且与血液中C18:1-Leu、 C18:1-Phe含量密切相关。血液PM20D1、C18:1-Leu及C18:1-Phe含量与肥胖及糖尿病相关参数呈显著正相关。我们还发现血液PM20D1及代谢物含量随着代谢综合征组分的数目增加。同时，磺酰脲类降糖药可以显著降低血液中PM20D1及代谢物含量。. 本项目动物研究发现，与对照组相比，过表达PM20D1的小鼠在22°C及30°C环境温度下未表现出明显的代谢表型。但是，过表达PM20D1的高脂饮食喂养的小鼠在6°C环境下脂肪含量显著下降，且糖耐受能力明显提高。进一步机制研究表明，在寒冷环境下，小鼠血液中锌离子浓度升高，并与192E位点结合，抑制了PM20D1的合成活性但对其水解活性无影响，导致血液中C18:1含量升高，进而改善了肥胖相关代谢疾病。. 本项目研究表明，PM20D1在肥胖相关的代谢疾病中发挥了重要的作用。PM20D1可作为代谢感受器“感知”环境温度变化调节其酶催化活性。