中华鲟Dmrt基因家族的克隆及表达特征研究

中华鲟是我国特有的珍稀鱼类，目前濒临灭绝。同时，其在进化生物学上亦占有重要的研究意义。目前，中华鲟的全人工繁殖技术尚未取得突破。另外，其野生种群中，雌鱼数量明显大大高于雄鱼。因此，本研究准备深入研究中华鲟的性别调控有何特殊分子机制。通过克隆得到中华鲟的Dmrt基因家族成员，并将其进行系统发育分析，构建分子系统树。构建表达载体pET32a(+)-Dmrt，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，通过IPTG诱导获得目的基因蛋白质产物，并利用His-tag亲和层析柱纯化目的蛋白质。将纯化目的蛋白分别免疫家兔及小鼠以制备相应抗体。进行Dmrt系列基因在中华鲟中的表达谱及细胞定位研究，并从分子进化的角度对其功能进行探讨。该项目的顺利完成，不仅有利于我们认识Dmrt基因家族在鲟形目这一古老鱼类中参与性别调控的分子机理，还可以为我们制定出更合理的措施来保护中华鲟这一珍稀物种提供帮助。

中华鲟(Acipenser sinensis)是我国特有的珍稀鱼类，国家一级保护动物，其野外种群数量目前处于濒危状态。为了深入了解其生长和生殖调控的相关分子机制，本研究通过RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends)技术，克隆得到中华鲟的Dmrt (dsx and mab23 related transcription factor)基因家族成员——Dmrt1，其全长1320bp, 有657bp的开放阅读框，共编码218个氨基酸。并对其进行了系统发育分析，构建了分子系统进化树。RT-PCR的研究发现其mRNA可在在3-龄雄性个体的精巢及肾脏组织中均有表达。同时，承本项目的资助，我们还克隆得到了中华鲟生长激素(growth hormone, GH)及阿黑皮素原(Proopiomelanocortin, POMC)基因。其中，GH基因全长954bp, 有642bp的开放阅读框，共编码214个氨基酸残基的成熟多肽。中华鲟GH与其它鱼类GH基因有很高的同源性。RT-PCR和Western blot分析表明，在中华鲟胚胎发育的14个特定时期，母源性GH持续高效表达，在幼鱼出苗3天后，可自身分泌表达GH。POMC基因共有2种亚型，其中POMC-A基因全长1122bp, 有792bp的开放阅读框, 共编码264个氨基酸。POMC-B基因全长1216bp, 有792bp的开放阅读框, 共编码264个氨基酸。研究发现，中华鲟POMC-B可能是一种进化上更为原始的基因。