睾丸特异表达激酶TSSK4调节雄性小鼠生殖的机制研究

In our previous work, we have elucidated that TSSK4 is a testes specific Serine/Threonine protein kinase. It is exclussively expressed in elongating and mature sperms. Both in vitro and in vivo, TSSK4 has phosphorylation and autophosphorylation activity.In vitro, it can phosphorylate itself on Thr-197 (Wei, 2013). In our present work, we have successfully generated TSSK4 deletion mice model. With the deletion of TSSK4, male mice show sub-fertility phenotypes according to abnormal sperm flagella structures as well as much less sperms with normal motile activity, but the molecular mechanism on TSSK4 regulating male fertility is remained to be elucidated. In this applying project, we will put all our efforts on elucidating this molecular mechanism. Firstly, we will find out the down-stream target molecular(s) that is (are) modified or regulated by TSSK4 using a variety of experimental procedures. Consecutive research work will be conducted to elucidate the relationships between TSSK4 and the candidated targeting molecules. With the completion of this project, mechanism on TSSK4 regulating male reproduction will be elucidated which will provide some theoretical basis for further clinical genetic research work concerning male sterility.

我们在前面的研究工作中已经阐明TSSK4 是睾丸特异表达的丝／苏氨酸激酶，它特异的表达在变形及成熟的精子细胞中,在体内外TSSK4具有磷酸化和自身磷酸化活性，其自身磷酸化位点是第197位的苏氨酸（wei,2013）。在本研究中我们已经成功的制备了TSSK4基因缺失小鼠模型，发现该基因缺失后雄性小鼠的生殖能力显著下降，其原因是精子尾巴结构异常以及由此导致的具有运动能力的精子数显著下降。但TSSK4是如何通过调节精子尾巴结构和运动从而调节雄性小鼠生殖能力的分子机制仍然不清楚，本项目拟对这一部分内容展开研究。我们首先拟采用多种实验手段寻找可能被 TSSK4调控的分子靶标，探寻该（些）靶分子与精子尾巴结构和运动的关系，进而研究TSSK4和该（些）目标分子的调控关系从而阐释TSSK4调控雄性小鼠生殖能力的分子机制，为后续临床上研究男性不育症的遗传因素提供一定的理论基础。

本研究项目是在前期成功的制备了TSSK4基因缺失小鼠模型的基础上展开的。在本研究中，我们发现TSSK4基因缺失后雄性小鼠的生殖能力显著下降，其原因是TSSK４基因的缺失导致精子尾巴结构异常以及由此导致的具有运动能力的精子数显著下降。在接下来的研究中，我们发现TSSK4通过与ODF2的相互作用，保证ODF2和TSSK4处于一个正反馈循环之中，ODF2作为精子尾巴的结构蛋白，能够很好的结合并富集TSSK4蛋白于精子尾巴的结构之上，聚集的TSSK4激酶通过自身磷酸化活性很好的维持在激酶活性状态，而具有激酶活性的TSSK4激酶又能够磷酸化ODF2蛋白，使精子的尾巴维持很好的结构和运动功能，从而调节雄性小鼠的生育能力。这一研究结果发表在Molecular human Reproduction (2015）上. 为了进一步阐释了TSSK4和ODF2相互调节的分子机制，我们制备了诸多ODF2的突变体，发现TSSK4对ODF2的磷酸化发生在第76位的丝氨酸上。为进一步用体内实验证明这一发现，我们定制了位点特异性的ODF2-Ser-76的单克隆抗体. 体内实验证明TSSK4基因敲除后，ODF2第76位的磷酸化程度显著降低，从而证明了TSSK4是磷酸化ODF2第76位丝氨酸的激酶之一。这一实验结果我们用质谱的数据进一步进行了确认。这一结果发表在Scientific reports (2016)上. 这些发现，阐释了TSSK4调节雄性小鼠生殖功能的分子机制，为临床研究男性不育提供了一个新的分子靶标。