小鼠/人类睾丸特异表达新基因LRRC18的功能研究

小鼠Lrrc18基因（mtLR1）及人类同源基因是我们克隆的在睾丸组织中特异表达的新基因，其表达模式呈时空特异性和生精细胞特异性，可能在精子形成过程中发挥重要的组织特异性功能。本研究拟运用慢病毒shRNA载体, 建立Lrrc18基因沉默小鼠模型，同时运用Cre-loxP 系统，建立Lrrc18基因敲除小鼠模型，研究该基因在睾丸发育和精子发生中可能的生物学功能。LRRC18蛋白含有4个亮氨酸串联结构模体,含该模体的蛋白质在器官形成和信号传递等方面提供一个蛋白质相互作用的框架，本研究拟通过pull down、质谱分析，免疫共沉淀等方法鉴定与之相互作用的蛋白；运用过表达和RNA干扰Lrrc18基因在细胞中表达，通过二维电泳和microRNA芯片分析差异表达分子，研究其在精子发生中可能的信号途径及分子机制，为男性不育患者的诊断和治疗提供新的思路和靶点。

研究组承担该项目以来，严格按照项目计划书进行，现已完成计划书中的各项指标，1年来共发表研究论文3篇，其中SCI收录2篇，培养研究生2人。. LRRC18基因及人类同源基因是我们克隆的在睾丸组织中特异表达的新基因，首先，我们采用第三代慢病毒包装系统，将含有特异性干涉LRRC18 的DNA 序列克隆入穿梭质粒pSicoR 中，构建siLRRC18-pSicoR 质粒。在脂质体介导下，siLRRC18-pSicoR 与包装质粒pLP1，pLP2，pLP/VSVG 共转染HEK293T 细胞，获得高滴度慢病毒颗粒。感染小鼠精原细胞系GC-1spg细胞，流式分选GFP 阳性细胞，检测精原细胞中LRRC18 的敲低效果。成功构建针对LRRC18 两个位点的RNAi 慢病毒载体siLRRC18-1 和siLRRC18-2 并获得慢病毒颗粒，病毒滴度检测可达1.3× 108 TU/ml。感染GC-1 细胞效率达31% 以上，siLRRC18-1 可下调LRRC18 mRNA 约76%，siLRRC18-2 约下调84%。LRRC18 的RNAi 慢病毒载体成功构建，为后续研究LRRC18 对GC-1spg 细胞的影响奠定基础。.　　　为了进一步研究LRRC18基因对细胞生长及凋亡的影响，我们将仅含LRRC18基因编码区的序列连接于带有sv40启动子的表达载体，构建LRRC18基因的表达重组体。通过脂质体转染技术将LRRC18基因导入GC-1spg细胞，筛选表达LRRC18基因的阳性细胞克隆，考察LRRC18基因的表达对GC-1spg细胞生物学行为的影响。实验结果表明：LRRC18表达可明显促进GC-1spg细胞的生长速率； 流式细胞技术分析显示，LRRC18基因可使GC-1spg细胞G1期细胞减少，S、G2期细胞相应增加，凋亡细胞减少。因此，LRRC18基因很可能在G1至S期及G2期的转换的调节中具有重要作用。此外，我们通过免疫共沉淀分析发现LRRC18与Hsp70和Hsp90存在相互作用，说明LRRC18基因可能通过JNKl基因而抑制细胞凋亡。