靶向PI3K/Akt /mTOR和GSK3β/APC/Axin的miRNAs网络对肝癌发病机制的调控

This study intends to use the miRBase, Cytoscape and other bioinformatics software, to describe the network among miRNAs, PI3K/AKT/mTOR ，GSK3B/Axin/APC and select specific molecular of miRNAs in liver cancer incidence , and then verified in clinical liver cancer tissues. Establish a miRNAs overexpressed/inhibit expression of liver cancer cell lines and corresponding animal model to verify the regulation of miRNAs and target genes.Then using Western Blot, confocal laser scanning technology ,flow cytometry instrument to detect the expression of key protein in signaling pathways,to verify the effect on hepatocellular carcinoma cell proliferation, apoptosis, invasion tumor.Revealing the regulatory mechanism,among miRNAs,PI3K/mTOR/Akt and GSK3/Axin/APC signal pathway network for the early onset of hepatocellular carcinoma.

微小RNA作为一种重要的调控子，可通过调控PI3K/AKT/mTOR与GSK3B/Axin/APC等信号通路影响肝癌的发生与发展，但三者之间的网络调控在肝癌发病机制中的研究，未见报道。本研究拟利用miRBase、cytoscape等生物信息学软件，绘制miRNAs、PI3K/AKT/mTOR和GSK3B/Axin/APC三者之间的网络调控图，筛选出调控肝癌发病中特异性的miRNAs分子，并在临床肝癌病人组织中进行验证；建立miRNAs过表达/抑制表达肝癌细胞系和相应的动物模型，验证miRNAs与靶基因的调控作用，并利用Western Blot、激光共聚焦技术、流式细胞仪检测其对信号通路关键蛋白的表达，验证其对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭及成瘤的作用，揭示miRNAs、PI3K/mTOR/Akt和GSK3?/Axin/APC信号通路网络调控对肝癌早期发病的调控机制。

肝癌严重影响人类健康，虽然很多microRNA被证明在肝癌中异常表达，但其影响肝癌进展的具体机制仍不清楚。microRNA 可影响靶基因表达级联调控信号通路从而发挥生物学功能，而PI3K/mTOR/Akt 和GSK3ß/Axin/APC 信号通路在肿瘤包括肝癌发生过程中有重要的影响。在本研究中，我们通过Targetscan等数据库预测了可能靶向PI3K/mTOR/Akt 与GSK3ß/Axin/APC信号通路中的关键蛋白MDM2、 mTOR、GSK-3 ß、AKT、PIK3CA等的miRNAs，经cytoscape绘制网络调控图及分析选择miR-1247-5p、miR-758-3p、miR-506-3p、miR-508-5p为可能的调控miRNAs。针对筛选的miRNAs，设计特异性qRT-PCR引物，检测其在肝癌组织和细胞中表达量发现miR-1247-5p、miR-758-3p、miR-506-3p在肝癌组织样本和细胞中均下调； miR-1247-5p作为肝癌诊断的 ROC曲线下面积为0.883，敏感性为78%，特异性为82.9%；miR-758-3p异常表达与HCC患者的血清AFP水平和TNM分期密切相关。通过预测miRNAs和靶基因结合位点，构建荧光素酶报告载体和miRNAs过表达和抑制表达细胞模型，进行双荧光素酶报告实验、westernblot、qRT-PCR、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验等，发现miR-1247-5p可抑制Wnt3、Smad2和DNMT3A表达调控WNT、TGFβ信号通路抑制肝癌生长，且miR-1247-5p在肝癌细胞中的低表达和其甲基化水平增高相关；miR-758-3p靶向MDM2和mTOR调控MDM2-p53和mTOR信号通路抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，miR-506-3p靶向PIK3CA抑制肝癌细胞HCC-LM3的增殖与转移；MiR-508-5p靶向SKP2和MAPK1调控肿瘤细胞HepG2、SGC7901、Hela和SW480进程。由此证实了miRNAs对肿瘤包括肝癌的生长调控可通过多个信号通路进行，初步阐明了miR-1247-5p、miR-758-3p、miR-506-3p、miR-508-5p网络调控PI3K/mTOR/Akt 与GSK3ß/Axin/APC调控肝癌生长的分子机制。