调控甘草黄酮生物合成的MYB转录因子的筛选与功能研究

Transcription factors can activate a series of synthetase producing specific secondary metabolites to coexpress and promote the product synthesis, so it is an effective ways to solve the problem of low yield in plant cell culture by using transcription factor to construct a transgenic cell lines of high yield. As the main active ingredient in Glycyrrhiza, flavonoids biosynthetic pathway has been very clear,but the regulation molecules and regulation mechanism of flavonoids synthesis is unclear.In this study, Glycyrrhiza cell from Erdos plateau as the object,High-Throughput Transcriptome Sequencing for MeJA treatment and mock-treated licorice suspension cells had found 12 transcription factors related to Glycyrrhiza flavonoids synthesis.It is proposed Chi gene (the key genes in the biosynthesis of flavonoids) promoter as bait for yeast one hybrid experiment to determine the MYB transcription factors involved in the regulation of flavonoid synthesis. Then the MYB transcription factors were transformed into cells overexpressing and specificity interference, and identified the binding sites with chi gene promoter using DNaseI footprinting and EMSA. After that, regulation effect of these MYB transcription factors to flavonoid synthesis and chi gene expression would be explored.By executing this project,it is expected to solve the problem of low yield and lay the foundation for promoting the industrialization process of large-scale cultivation of licorice cells.

转录因子可激活特定次生代谢产物系列合成酶的协同表达，促进该类产物的大量合成，因而利用转录因子构建高产转基因细胞系是解决目前植物细胞培养产量低的有效途径。黄酮类化合物作为甘草中的主要活性成分，其生物合成途径已非常明晰，但调控黄酮类合成的分子及其调控机制尚不清楚，本项目以鄂尔多斯高原甘草细胞为研究对象，在对经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导前后的甘草悬浮细胞进行转录组高通量测序，通过比较发现12个可能参与甘草黄酮类合成相关的MYB转录因子的基础上，拟以甘草黄酮合成途径中的关键基因chi启动子为诱饵进行酵母单杂交实验，确定参与调控甘草黄酮合成的MYB转录因子，将其转化到甘草细胞中进行过表达及特异性干涉，并利用DNaseI足迹法和EMSA确定其与chi基因启动子的结合位点，确定参与调控甘草黄酮合成的MYB转录因子及其调控效应，为推动甘草细胞大规模培养的工业化进程奠定基础。

转录因子可激活特定次生代谢产物系列合成酶的协同表达，促进该类产物的大量合成，因而利用转录因子构建高产转基因细胞系是解决目前植物细胞培养产量低的有效途径。黄酮类化合物作为甘草中的主要活性成分，其生物合成途径已非常明晰，但调控黄酮类生物合成的分子尚不清楚，本项目以鄂尔多斯高原乌拉尔甘草细胞为研究对象，在建立稳定的细胞悬浮培养系的基础上对该体系进行了动力学分析，获得细胞生长、基质消耗及产物合成的非结构动力学模型。对经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导前后的甘草悬浮细胞进行转录组高通量测序，筛选到了 11 个可能参与甘草黄酮类合成相关的 MYB 转录因子并克隆到这11个转录因子基因；克隆甘草黄酮生物合成的关键酶-查尔酮异构酶 chi 基因，采用染色体步移技术获得chi 基因的启动子，以chi 启动子为诱饵与获得的的具有显著差异的 11个 MYB转录因子进行酵母单杂交，确定了参与调控甘草黄酮合成的 4个MYB 转录因子。. 其次探讨了筛选到的这4个MYB转录因子对甘草黄酮类化合物生物合成的转录调控机理及其调控效应，通过构建亚细胞定位载体转化烟草叶片确定这些筛选到的转录因子均位于细胞核内；通过构建过表达载体建立转GlMYB4基因甘草悬浮细胞系， RT-PCR分析表明GlMYB4基因在随机选取的转基因细胞系中均正常表达并且相对于未转化的细胞转录水平均上调。将转基因细胞系在添加潮霉素的选择性培养基上连续继代培养5个月后检测甘草黄酮含量，结果显示转pGlMYB的甘草细胞甘草黄酮的平均含量比未转化的甘草细胞黄酮产量提高了0.92倍，从分子水平上揭示这些 MYB 转录因子参与调控甘草黄酮合成的机制，为阐明甘草细胞中黄酮合成的转录调控以及甘草细胞分子育种打下基础。有望解决甘草悬浮细胞产量低的问题，为推动甘草细胞大规模培养的工业化进程奠定基础。