通阳活血方通过微管蛋白β-tubulin调控乳兔缺血再灌窦房结细胞钙钟机制研究

Sick sinus syndrome is refractory arrhythmia, lack of effective drug for treatment. Tong Yang Huoxue Recipe is a original prescription of Liu Zhiming treatment of sick sinus syndrome. It has many years of clinical accumulation and significant effect. Basic research found that the recipe increased pacing-related current and β-tubulin. Recent research shows that β-tubulin is involved in the regulation of calcium clock, while calcium clock plays a key role in sinus node pacing. According to this hypothesis: Tong Yang Huoxue Prescription for the treatment of sick sinus disease is through the improvement of β-tubulin, regulating calcium clock, calcium balance and balance calcium intake, thereby protecting the sinoatrial node cells in electrical activity and improve heart rate. This project selected rabbit rabbit model of ischemia-reperfusion sinus node cells, using patch-clamp, laser confocal and other techniques to observe the side of β-tubulin and calcium clock [electrophysiological (ICa-L, INCX) (RyR2, SERCA2a), intracellular calcium (Spontaneous release of calcium, Calcium wave, ［Ca2+］i）]. To further construct the model of overexpression and knockdown of β-tubulin gene in rabbit sinoatrial cells and validate the above hypothesis . To clarify the role of Tongyang Huoxue Recipe in regulating Calcium Clock in ischemic-reperfused sinoatrial node cells and to provide a theoretical basis for inheriting the famous traditional Chinese medical experience in the treatment of sick sinus.

病态窦房结综合征是难治心律失常，缺乏有效药治疗。通阳活血方是国医大师刘志明治疗病窦原创方，数年临床研究，疗效显著。基础研究发现该方增强起搏相关电流，增加微管蛋白β-tubulin。最新研究表明，β-tubulin参与调控钙钟，而钙钟在窦房结起搏中起关键作用。据此假说：通阳活血方治疗病窦机制是通过提高β-tubulin，调控钙钟，平衡钙释放和钙摄取，从而保护窦房结细胞电活动功能，提高心率。本项目选乳兔缺血再灌窦房结细胞模型，用膜片钳，激光共聚焦等技术，观察该方对β-tubulin及钙钟[电生理（ICa-L、INCX），钙转运分子（RyR2，SERCA2a）,胞内钙离子（自发性钙释放，钙波，［Ca2+］i）]的作用；进一步构建乳兔窦房结细胞β-tubulin基因过表达及敲低模型，验证上述假说。明确通阳活血方通过β-tubulin调控受损窦房结细胞钙钟机制，为本项目创新，为治疗病窦提供理论依据。

通阳活血方（TYHX）是国医大师刘志明治疗病窦原创方，临床疗效显著。项目研究发现“钙钟-膜钟”在窦房结的自律性中扮演着重要角色，可能是TYHX的主要治疗靶点。前期研究证实通阳活血方可以通过微管蛋白β-tubulin调节窦房结的自律性，但是具体机制尚未解析。本项目利用离体电生理、激光共聚焦、电镜和分子检测技术，从“细胞—分子—超微结构”三个层次，明确乳兔模拟缺血再灌注窦房结细胞（SANC）自律性明显降低，ICaL和INCX内向电流减弱，细胞内钙超载，RyR2、SERCA2a、Cav1.3、NCX1.1介导的钙释放、钙回收和钙转运失衡，这可能是病态窦房结综合征（病窦）出现心动过缓的重要机制。利用通阳活血方干预后SANC自律性增加，ICaL和INCX内向电流增强，细胞内钙超载被抑制，RyR2、SERCA2a、Cav1.3、NCX1.1介导的钙释放、钙回收和钙转运重新恢复平衡，并且该机制受微管蛋白β-tubulin调节。TYHX不同剂量研究显示高剂量较中、低剂量更优效的调节ICaL和INCX、钙释放、钙回收和钙转运蛋白，为临床应用提供了依据。研究中发现“钙钟”的钙稳态平衡是窦房结功能恢复的重要机制，而钙稳态平衡受线粒体稳态调节，因而进一步增加了新的研究内容：从“钙稳态-线粒体稳态”角度的研究。创新发现TYHX能够通过调节β-tubulin恢复线粒体膜电位水平，抑制Drp1向线粒体过度迁移、调节Fis1和Mfn1介导的线粒体融合/裂变机制，提高线粒体自噬水平，维持线粒体呼吸链功能和线粒体能量代谢水平，抑制钙超载并维持钙稳态平衡。本研究阐述了“钙钟”和“膜钟”紊乱及“线粒体稳态”失衡导致病窦的全新机制，是“钙钟”理论的重要补充和延展性研究。课题从中医“通阳活血”新思想治疗病窦，为中医药干预病窦作用机制研究及临床应用提供了科学依据。