慢病毒介导的RNAi沉默IL-1I型受体联合无热量超短波对鼠关节炎的治疗作用及机制的研究

Osteoarthritis is a common existing .The treatments can only slow down the development. Gene therapy is a current research focus, but the gene transfection rate is limit, so the Gene therapy is only in laboratory researc. When to make gene therapy into the clinic as soon as possible is a problem currently plaguing everyone. Pulsed electric field can cause a transient change in membrane permeability, and is safe, no side effects. Take advantage of this change for gene therapy is to study one of the hot. Ultrashort wave is a high-frequency pulsed electric ,and it is commonly used in the treatment of osteoarthritis in the clinical. it has penetrating, painless, so patients obey the characteristics of high. That the impact of ultrashort wave of inflammatory mediators, mainly through the non-thermal effects. Ultrashort wave of non-thermal effects related to changes in membrane permeability over? If you can affect the permeability of the membrane, then combination therapy with virus gene transfection, it increases the transfection efficiency? Studies have shown that lentivirus-mediated RNAi silencing of IL-1 receptor type Ⅰ Suppression of experimental knee osteoarthritis mitogen-activated protein kinase original expression. In this study, the joint success of gene therapy transfection of ultrashort wave of heat to intervene in SD rats on rat chondrocytes and osteoarthritis, try to confirm the above assumptions, provide an idea of the clinical treatment of the gene.

骨性关节炎是一种常见病，现有治疗仅能延缓其发展。基因治疗是目前研究热点，但受到基因转染率等限制，仅能对其进行实验室研究，何时能让基因治疗尽早进入临床是目前困扰大家的一个难题。脉冲电场能引起细胞膜通透性一过性改变，且是安全、无副作用的。利用这种改变进行基因转染治疗也是研究热点之一。超短波是临床上常用于治疗骨性关节炎的高频脉冲电场，具有穿透性好、无痛、患者服从性高的特点。认为超短波对炎性介质的影响，主要通过非热效应实现。那么超短波非热效应是否与膜通透性的一过性改变有关呢？如果可影响膜的通透性，那么与病毒转染的基因进行联合治疗时，是否可增加转染率呢？有研究显示慢病毒介导的RNAi沉默IL-1Ⅰ型受体能抑制实验性大鼠膝骨关节炎丝裂素原激活的蛋白激酶表达。本实验采用这一成功的转染基因治疗方法联合无热量的超短波来对鼠软骨细胞及骨关节炎的SD大鼠进行干预，尝试证实以上假设，为基因的临床治疗提供一个思路。

如何提高基因的有效转染率是骨关节炎基因治疗的研究热点。脉冲电磁可引起细胞膜通透性一过性的改变。超短波是临床上常用的高频脉冲电场，具有无痛、舒适、依从性高的特点。研究目的：尝试证实超短波非热效应的机制与改变细胞膜一过性的通透性有关；细胞膜一过性通透性改变联合慢病毒为载体的基因转染时，可增加其基因转染效率；通过对MMP-13、Ⅱ型胶原的观察，尝试证实抑制IL-1R的治疗作用，可能与MAPKs通路有关。方法：略。结果：1.采用扫描电镜抓拍到无热量超短波(SW)作用软骨细胞时电穿孔瞬间。2.采用流式细胞学检查，被不同时间SW作用的软骨细胞与对照组软骨细胞相比，凋亡无差异，不会引起软骨细胞凋亡增加。3.不同时间SW干预联合慢病毒介导GFP对转染率影响，显示同一病毒滴度组的细胞在不同作用时间SW的转染率差别存在统计学意义。SW作用时间与病毒滴度之间存在交互作用。不同病毒滴度组之间转染率差异存在统计学意义，10ul病毒滴度组的转染率高于5ul病毒滴度组的转染率。在同一病毒滴度范围内，SW干预30分钟时，转染率最高。4.不同时间SW干预联合shIL-1R干预对细胞IL-1R的表达存在统计学差异，且SW干预时间越长联合shIL-1R干预，越能有效的抑制IL-1R的表达。5.采用Western blot检测干预后软骨细胞的IL-1R、MMP-13、Ⅱ型胶原蛋白表达量，IL-1组，SW组，shIL-1RI RNA组，shIL-1RI RNA+SW组，各组间差别存在统计学意义。6.建立SD大鼠骨关节炎模型，采用免疫组织化学方法检测IL-1组，SW组，shIL-1RI RNA组，shIL-1RI RNA+SW大鼠右膝软骨组织的IL-1R、MMP-13、Ⅱ型胶原蛋白的表达，各组间的差别存在统计学意义。结论：1.无热量超短波可引起软骨细胞膜通透性可逆性改变，且不会增加软骨细胞的凋亡。2.无热量超短波联合慢病毒介导的抑制型IL-1R基因转染时，可增加其基因转染效率。3.无热量超短波联合慢病毒介导的抑制型IL-1R基因转染时，可有效的抑制IL-1R、MMP-13的表达，增加Ⅱ型胶原表达，但其机制有待进一步的研究。本课题已培养研究生3名，论文1篇已投稿。