冷冻电子断层技术研究线粒体膜蛋白复合物

Mitochondria is a key organelle which plays a variety of crucial roles in energy metabolism, apoptosis, transportation of metabolites, protein trafficking and folding, redox signaling and other metabolic pathways in eukaryotes. Defects in mitochondrial membrane proteins can cause severe diseases including cancer, diabetes, etc. Many of the important functions of mitochondria are carried out by its functional protein complexes, which are mostly synthesized on cytosolic ribosomes and are imported into the organelle. The translocase of the outer membrane (TOM complex), the main entry gate of the mitochondria, together with the translocase of the inner membrane (TIM complex), are responsible for the translocation of mitochondrial protein complexes in general. However, the precise mechanism underlying the translocation process still remains elusive due to the lack of the high resolution in situ 3-D structure of the TIM-TOM complex. In this project, we will use cryo-electron tomography (cryo-ET) as the main tool, complemented by cryo-electron single particle analysis (cryo-EM SPA), biochemistry and cell biology assay to reveal the detailed structural mechanism of the translocation in situ. We will do the following: 1) Obtain a high-resolution structure of the TIM-TOM whole complex using cryo-EM SPA on nano-disc and liposome; 2) Identify and examine the TIM-TOM complex directly in the mitochondrial membrane..This project will answer the important question of how exactly does the TIM-TOM complex carry out the translocation by showing its detailed in situ structure on the mitochondrial membrane. It will be the first in vivo native high-resolution structure of the mitochondrial membrane proteins.

线粒体存在于大多数真核细胞中，是极重要的细胞器，其内外膜上有许多重要的膜蛋白复合物，这些复合物在能量代谢、胞内运输、细胞凋亡等多个方面起着至关重要的作用。线粒体病变会导致多种疾病，因此对线粒体及膜蛋白复合物的结构与功能研究一直是国内外科研热点，其研究结果对生命科学、基础医学和人类健康有着极重要意义。目前已有多位科学家凭借在线粒体研究方面的杰出贡献而获诺贝尔奖。本项目以冷冻电子显微学电子断层作为主要技术手段，综合利用冷冻电子显微学单颗粒重构，生物化学，细胞生物学等技术，来解析线粒体运输复合体TIM-TOM的三维原位高分辨结构，从而深入理解线粒体跨膜运输的分子机制。该项目的完成不仅能为线粒体相关的疾病与紊乱提供坚实的结构生物学基础，而且也能搭建并完善冷冻电子显微学电子断层技术在解析原位膜蛋白复合物结构方面的实验技术平台，从而为其他系统的原位大分子复合物的高分辨结构解析提供重要的参考价值与依据。

线粒体是细胞内重要的细胞器。线粒体在能量代谢、细胞凋亡、胞内氧化还原平衡、癌症生物学等各方面均起重要作用。线粒体功能离不开线粒体内各种蛋白质复合物，其中较重要的有负责把~99%的由核基因编码的线粒体蛋白运输进线粒体各部位去行使功能的转运复合体，以及连接线粒体相互作用的蛋白复合物——它们连接线粒体与线粒体，线粒体与其他细胞器，由它们所参与的线粒体互作在细胞生理功能和病理过程中很重要。因此本项目研究两方面，一是以线粒体生理功能为切入点，以解析体外酵母线粒体转运复合体TIM-TOM结构为依据，加深我们对线粒体转运及线粒体生理功能的理解；二是以线粒体在肿瘤里的结构变化为切入点，以研究神经胶质肿瘤细胞里线粒体的分布、形态、独特三维精细结构及相互作用方式为模型，加深我们对线粒体在神经胶质肿瘤里所起的作用以及相关机制的认识，并提取出可以用于帮助肿瘤诊断、区分不同肿瘤细胞的原位线粒体冷冻电镜三维结构特征。. 项目的第一个方面为解析酵母线粒体转运复合物的冷冻电镜结构。我们通过体外模拟线粒体在胞内的转运过程，利用改造的线粒体前体蛋白b2Δ-DHFR提纯出了少量TIM-TOM复合体和大量TOM40复合体。我们解析了TOM40复合体的3.7Å高分辨率冷冻电镜结构并构建了原子模型，结构分析为线粒体转运的新动态机制提供了新证据。. 项目的第二个方面为研究线粒体在神经胶质肿瘤里的结构。我们使用改良的电子断层成像步骤，随机在单细胞层次拍摄了多种神经胶质肿瘤细胞不同部位的线粒体并构建了精细三维结构。我们发现不同肿瘤细胞及正常细胞里线粒体出现频次、大小、分布、精细结构等均存在显著性差异。我们发现了癌细胞内新的线粒体互作结构，并通过结构分析发现它可能受微管结构的影响。我们提取出线粒体原位结构特征，用于区分不同种类的细胞和预测细胞类型。我们相信这个研究能够说明Cryo-ET有着发现新原位结构特征，从而协助肿瘤诊断的潜在价值。