miR-29b/miR-145 在HDAC4介导的Sox9-Runx2平衡及其在软骨细胞肥大化中的作用机制研究

Tissue engineering cartilage fibrosis always lead to unsatisfied result in articular cartilage repairing, this could be mainly attribute to seed cell hypertrophy caused by the unbalanced expression of Sox9-Runx2. But the molecular mechanism remain unknown. The project proposes to figure out the mechanism and designs to delay the process of cartilage fibrosis. As miR-145 has been verified to regulate Sox9 in chondrogenic differentiation, our previously study showed a significant decrease in expression of miR-145 and miR-29b during the hypertrophy process. And HDAC4 is a negative feedback factor in the regulation of Sox9-Runx2 balance while HDAC4 is also a target of miR-29b. So we propose a hypothesis that "miR-29b/145 participate in chondrocytes hypertrophy by regulating Sox9-Runx2 balance". In this project, 293 cell will be cultivated to detect the interaction between miR-145 and miR-29b. Mesenchymal stem cells will be utilized for miR-145 and miR-29b localization. Under gain of function and loss of function method, we'll study how miR-145 and miR-29b would affect the proliferation, differentiation,hypertrophy process of mesenchymal stem cells and clarify their role in Sox9-Runx2 balance. By utilizing nude mice subcutaneously implantation and cartilage defect repair model, the effects during cartilage formation by block or upregulate miR-145 and miR-29b are expected to be indicated. This research will provide knowledge for the regulation of chondrogenic differentiation of stem cell as well as offer theoretical support for cartilage repair in biomedical engineering field.

组织工程软骨纤维化导致关节软骨修复不佳，Sox9-Runx2失衡引起的种子细胞肥大化是其主因，但机制不详,故本课题以此切入探求延缓软骨纤维化的机制。在证实miR-145调控Sox9参与软骨分化的基础上，预实验发现肥大进程中miR-145和miR-29b显著下调。基于miR-29b靶分子HDAC4是调控Sox9-Runx2平衡的负反馈分子，因此提出"miR-29b/145调控Sox9-Runx2平衡参与软骨细胞肥大化"假说。拟利用293细胞检测miR-145和miR-29b相互作用及可能方式；利用MSCs进行该miRNA对的细胞学定位；观察功能干预下，其对MSCs成软骨分化中增殖、分化、肥大化等表型的影响，明确对Sox9-Runx2平衡的改变；在体裸鼠种植和软骨修复模型，阐述阻抑或上调该分子对对软骨形成的效应改变。本研究将为干细胞软骨分化调控积累基础资料，也可为工程化软骨修复提供理论指导。

如何抑制间充质干细胞（MSCs)软骨肥大化进程，稳定MSCs来源的软骨细胞表型，已成为推进MSCs用于关节软骨修复中亟待解决的重要问题。探求MSCs成软骨分化中，尤其是肥大化进程中对Sox9-Runx2平衡的调控机制，有可能为探索切实有效的稳定MSCs来源的软骨细胞表型提供基础，同时也有益于推进组织工程软骨在临床的应用前景。Sox9-Runx2平衡是调节肥大化进程的重要分子对,microRNA（miRNA）在干细胞的干性维持和分化中具有重要的功能。作为一类参与基因转录后水平调控的非编码的单链RNA，miRNAs 为双向基因，精确调节目的基因的实时表达，参与人类骨骼肌肉系统形成的多条信号通路。microRNA的作用机理为我们提供了一种全新的视角，用来进行阐释MSCs中Sox9-Runx2平衡的调节机制，尤其是其在成软骨分化进程中肥大化的分子机制方面，有望取得一些新的资料和发现。. 本课题从三方面来证实“miR-145/miR-29b调控Sox9-Runx2平衡参与软骨细胞肥大化”假说：（1）沉默miR-145可否延缓小鼠来源的MSCs软骨肥大分化进程；（2）在IL-1β诱导人的OA软骨细胞模型中，miR-145能否影响软骨细胞表型；（3）观察功能干预下，miR-29b对MSCs成软骨分化中增殖、分化、肥大化等表型的影响，验证其对Sox9-Runx2平衡的改变。实验证实了：在软骨细胞肥大化模型中，miR-145/miR-29b高表达，能通过调控Sox9-Runx2平衡来影响软骨细胞分化与稳态，如促进细胞外基质降解，抑制Ⅱ型胶原的合成，促进MMP13的合成等；分别沉默这两种miRNA,都能有效延缓肥大化进程，如Ⅱ型胶原何细胞外基质增多，MMP13的合成减少；在人的OA软骨细胞模型中，miR-145抑制剂能减轻软骨肥大化症状，为临床软骨修复提供一种潜在的治疗策略。研究结果有望为MSCs定向成软骨细胞分化和肥大化的分子机制的阐明积累实验基础，为临床上利用miRNAs基因工程调控软骨细胞的生物学行为奠定基础，尤其是工程化软骨修复提供理论基础。. 本项目已经完成了计划内容，已发表SCI 10篇，国内CSCD2篇,获发明专利2项，国内会议报告7次。通过本课题的研究，毕业硕士4名,在读博士研究生2名，硕士研究生2名。按国家自然基金财务规定执行，经费严格按预算使用。