MYO5B突变影响肝细胞胆盐外运泵的机制及其与肝脏表型关系

Primary bile salt export pump (BSEP) would lead to severe cholestasis. Our recent study newly found that MYO5B defect causes a full spectrum of isolated intrahepatic cholestasis, without classical phenotype of diarrhea (Hepatology, 2017). Its similarity to primary BSEP defect in changes of clinical presentation, liver pathology and bile acid profiling suggested secondary BSEP dysfunction. The re-location of BSEP requires MYO5B-RAB11A interaction but such theory couldn’t perfectly explain the BSEP abnormality and the phenotype difference. It is still unclear about MYO5B function within hepatocyte, so in this study, we plan to construct in vitro and in vivo MYO5B hepatocyte knockdown/knockout models & related rescue experiments, and by live cell imaging, RNA-seq, quantitive proteinomics etc. we try to elucidate the MYO5B function within hepatocytes and how its mutants affect the BSEP life cycle; we also plan to construct stable MYO5B knockout hepatocyte/enterocyte models in vitro, and by transfecting MYO5B plasmid and mutated MYO5B plasmids from both phenotype separately, we try to explain how different mutations cause phenotype difference. Such findings will provide clues for precise treatment in MYO5B defects and other cholestasis.

胆盐外运泵(BSEP)的原发功能缺陷导致严重胆汁淤积症。我课题组新鉴定MYO5B突变致肝内胆汁淤积谱系(Hepatology 2017)，不伴经典腹泻表型；临床、病理、胆汁酸谱的改变与原发BSEP缺陷病极为相似，提示继发BSEP功能障碍可能是引起胆汁淤积的机制。目前认为MYO5B-RAB11A相互作用为BSEP重定位所必需，但无法完美解释胆汁淤积原因和不同突变的表型差异机制。由于MYO5B在肝细胞中的功能仍不清楚，本研究拟通过构建MYO5B体内外敲低/敲除模型及挽救实验，应用活细胞显像、组织化学、RNA-seq、定量蛋白组学等探明MYO5B在肝细胞中具体功能及MYO5B缺陷影响肝细胞BSEP的具体机制；通过体外肝/肠上皮细胞MYO5B敲除模型，分别转染不同表型特有的MYO5B突变质粒，探究不同MYO5B突变引起不同表型的机制，为MYO5B突变及其它原因胆汁淤积症的治疗研究提供理论依据。

课题组前期鉴定MYO5B变异可导致不伴经典腹泻表型的低GGT胆汁淤积症，并通过免疫组化和胆汁酸代谢组学提示可能通过影响胆盐外运泵(BSEP)定位或功能而致病。本项目分析原发性BSEP缺陷患者肝组织与MYO5B缺陷患者肝组织转录组测序，发现两者差异通路/基因非常相似；在HepG2 MYO5B敲除细胞株(HepG2ko)中过表达Rat-Bsep未见Bsep 分布异常，但转入患儿变异 MYO5B 质粒，可观察到Bsep分布异常；与荷兰格罗宁根大学Sven教授合作发现保留RAB11A结合位点的MYO5B错义突变可通过毒性获得作用（gain of toxic）导致毛细胆管膜转运体MRP2定位异常。.通过CRISPR/Cas9构建了Myo5b肝特异性敲除（Myo5b-cko）小鼠。Myo5b-cko小鼠自身不存在Bsep分布异常，也无胆汁淤积表现；尝试1%胆酸饲料和胆管结扎，Myo5b-cko小鼠和野生小鼠无区别；尝试0.1% DDC饲料，观察到Myo5b-cko鼠肝组织胆栓面积相比野生型对照明显减少，和文献报道的BSEP敲除鼠相似；尾静脉注射含患儿MYO5B错义变异序列腺病毒，Myo5b-cko鼠可部分复现 Bsep 分布异常，从动物模型层面为MYO5B错义突变可通过毒性获得作用导致胆汁淤积提供了支持依据。.为探讨敲除MYO5B不发生胆汁淤积可能的代偿机制，在细胞实验中，本项目对HepG2par、HepG2ko，过表达野生型MYO5B和错义变异MYO5B细胞株进行转录组测序，通路富集分析发现胆汁酸代谢及细胞极性相关通路有不同程度改变。此外在细胞实验中还探索了MYO5A是否是肝细胞MYO5B缺失后的替代途径，但实验结果显示HepG2 par与HepG2KO分别敲减MYO5A后，毛细胆管膜转运体MRP2的定位和表达并无明显差别，提示其他代偿机制存在。.基因型-表型研究显示患者肠道症状严重程度与其携带的无功能变异个数呈正相关，胆汁淤积患者中有无功能变异者倾向于表现为持续性胆汁淤积；错义/非框移变异定位于MYO5B蛋白非Motor 区，尤其是IQ区的患者更可能表现为单纯低GGT胆汁淤积。还对MYO5B内含子和同义变异进行了功能学分析及致病性定义。依托本项目发表SCI论文15篇（单篇最高影响因子17.298），中文综述1篇，申请专利2项; 培养硕士4名，博士4名，博后1名。