脂肪干细胞微泡携带let-7促进游离脂肪移植后血管新生作用与机制研究

Autologous fat transplantation is an ideal choice to repair tissue defects.But it has hit a bottleneck on its therapeutic effect due to the ischemia and hypoxia which lead to the death of many adipose cells.How to trigger angiogenesis as soon as possible becomes a vital issue.Base on our previous study,it has been proved that the microvesicles secreted by adipose-derived stem cells(ASC-MVs) carring angiogenesis miRNA let-7 can improve the migration and angiogenesis of human vascular endothelial cells,and its mechanism may land on that ASC-MVs can transfer angiogenesis microRNA to vasular endothelial cells.Base on our preliminary experiment,ASC-MVs can accelerate angiogenesis after free fat graft.But its mechanism is not clear.Thus,the following research will focus on the mechanism of angiogenesis leaded by ASC-MVs in ischemia and hypoxia,the mechanism of ASC-MVs transfering angiogenesis microRNA and accelerating angiogenesis after free fat graft via by techniques concerning tissue transplation, protein biochemistry,genetic testing and three-dimensional vessel building.The fruit of these research will offer reliable theorethical basis and experimental evidence to the application of ASC-MVs in free fat graft.

自体脂肪移植是目前软组织填充的首选方案，但由于移植早期的缺血缺氧环境导致移植物中大量脂肪细胞坏死吸收，从而限制了其临床推广。如何促进移植物快速建立充分的血供是保障其存活的关键。我们前期研究发现，由脂肪干细胞旁分泌的微泡（ASC-MVs）可携带具有促血管化作用的miRNA let-7进入血管内皮细胞并促进其迁移和管样分化。进一步研究发现ASC-MVs还能促进游离脂肪移植后血管新生，据此我们推测ASC-MVs可向移植区的血管内皮细胞传递let-7从而加速血管新生。本研究拟围绕这个重要的科学问题展开，采用组织移植、蛋白生化、基因沉默、体外三维血管构建等技术,重点研究在缺血缺氧环境下ASC-MVs调控血管内皮细胞管样分化作用，ASC-MVs传递let-7的机制，let-7促进血管新生的关键信号通路，以揭示ASC-MV促进游离脂肪移植后血管新生的主要途径，为其在游离脂肪移植领域的运用提供实验依据。

脂肪移植早期血管新生能力不足是影响移植物成活的重要因素，并导致其填充后的远期效果亟待改善。人脂肪干细胞（hADSCs）的细胞外囊泡（EVs）被报道具有促血管生成能力，但其具体分子机制尚未阐明。因此，我们的研究旨在评估hADSC-EVs对脂肪移植转归的影响，并探讨hADSC-EVs促进脂肪移植血管新生的分子机制。通过在常氧（21% O2）和低氧（5% O2）的细胞培养条件分别孵育hADSC，并从上清液中收集EVs。低氧hADSC-EVs与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在低氧环境中共培养，与hADSC-EVs相比可进一步促进细胞的增殖，迁移，成管和AGO1/VEGF信号通路的上调。同时，低氧hADSC-EVs联合人脂肪抽吸物在裸鼠皮下进行脂肪移植，相较hADSC-EVs可进一步提高移植物的成活率，促进移植早期外源性的血管新生，但对宿主来源的内源性血管新生无明显作用。为了进一步探索以上结果的分子机制，我们通过对hADSC-EVs进行MicroRNA高通量测序，发现低氧处理可显著提高hADSC-EVs中let-7家族的表达。let-7被报道为一种低氧诱导基因，可参与低氧刺激下的血管新生，在组织损伤、修复、再生中有重要意义。我们发现hADSC-EVs可通过通过AGO1/VEGF信号通路促进血管新生。通过LIN28B导入hADSCs来获取let-7低表达的EVs，发现let-7低表达的hADSC-EVs 上调HUVECs中AGO1/VEGF信号通路的能力显著降低，且促进HUVECs迁移，成管的能力下降。此外，let-7低表达的hADSC-EVs对脂肪移植物早期外源性血管生成和远期的成活率的提高均较正常hADSC-EVs有所下降。因此，我们得出结论低氧hADSC-EVs可通过上调let-7 /AGO1/ VEGF信号通路促进脂肪移植后的外源性血管新生。. 除了课题设计以外，我们还发现hADSC-EVs具有诱导巨噬细胞M2极化的作用，且通过在免疫能力正常的C57小鼠脂肪移植后每周移植物内注射hADSC-EVs，发现可促进移植物早期高表达解偶联蛋白1（UCP1）的米色脂肪新生，并伴更多的新生血管出现，但其分子机制任需进一步研究。