耐酸性罗丹明螺酰胺用于超分辨荧光生物成像

Fluorescent dyes, which are used in the single molecule localization based super-resolution fluorescence imaging, should possess both high emission intensity and photo-induced fluorescence switching properties. Then they can be used to image by means of stochastic optical reconstruction. Rhodamines have high fluorescence intensity and good photostability. Among these dyes, rhodamine spiroamides can switch the spiro-ring by illumination. Modification on these molecules can extend the photoactivation wavelength from the ultraviolet to visible light and show great potential in the super-resolution fluorescence imaging. However, the biggest drawback of these dyes is that the acid can also lead to the fluorescence switching of rhodamine amide, which will result in the background fluorescence interference in the super-resolution imaging process. Our previous work found that the rhodamine amine-substituted spiroamides show good chemical stabilization in the pH range from 1 to 14, which solves the acid-sensitive problem of spiroamides. On this basis, the project will continue to modify the rhodamine amino-substituted spiroamide and realize the visible light activated fluorescence switch. Then we will further modify on the rhodamine to improve its fluorescence intensity. SNAP or halo protein tag will be linked to the finally created acid-resistant rhodamine amino-substituted spiroamide, enabling single molecule localization and super-resolution imaging in living cells.

基于单分子定位的超分辨成像需要荧光染料既有高荧光强度，还具有光致荧光“开-关”功能，从而通过随机重构的方式成像。罗丹明染料具有高荧光强度和光稳定性，其螺酰胺衍生物具有光致螺环开关功能，且通过修饰能够将紫外光激发延长为可见光激发（>400nm），在超分辨成像中表现出巨大潜力。但这类分子的最大缺点是酸同样能够引起罗丹明酰胺螺环的开关，这种酸引起的荧光开关严重干扰了光致荧光开关，造成超分辨成像信息的失真。我们在前期工作中在罗丹明螺酰胺邻位引入氨基，这种氨基酰胺螺环在pH 1-14的范围内化学稳定，有效排除了螺环酸敏感对超分辨成像的干扰。在此基础上，本项目对罗丹明氨基螺酰胺进一步修饰实现可见光激发螺环开关，对罗丹明母体进行改造以进一步提高荧光强度，将SNAP或Halo等蛋白标签分子引入罗丹明氨基螺酰胺，实现罗丹明荧光团在单分子的定位，最终将创制的耐酸性罗丹明氨基螺酰胺荧光染料用于活细胞超分辨成像。

超分辨荧光成像技术突破了光学衍射极限，实现了在分子水平上对细胞精细结构、动态过程和功能的观察，使得人们能够在更精细的层次上理解各种生命过程，对生命科学的发展意义重大。其中荧光染料在超分辨成像中起着核心的作用，但现有的荧光染料性能难以满足超分辨成像的要求。因此，当前研究的焦点集中在荧光染料性能的提高上，包括提高荧光强度和光稳定性以满足超分辨荧光成像的要求。基于单分子定位的超分辨荧光成像技术需要荧光染料既具有荧光“开-关”功能，又满足有高荧光强度和好的光稳定性。罗丹明类染料具有高荧光强度和光稳定性，其螺内酰胺衍生物在中性环境下因具有光激活荧光开关功能而被广泛应用在随机光学重构显微镜（STORM）成像。然而当这类染料应用于酸性环境中其光激活性能将会失效而无法应用于超分辨荧光成像，因此发展耐酸性且光可激活的罗丹明螺酰胺已然是一个严峻的技术挑战，但其对于扩大这类染料在STORM成像的应用范围越来越有必要。本项目研究发现了一系列具有优异光激活性能的耐酸性罗丹明3-氨基螺酰胺分子，核磁、单晶和计算结果显示其独特的耐酸性主要来源于分子内氢键产生的“锁环”效应以及减弱的推拉电子效应，两者共同抑制了罗丹明螺酰胺的开环。我们对开发的耐酸性罗丹明螺酰胺类染料进一步共轭修饰6-苯乙炔基萘酰亚胺，将激活光的波长红移到了可见光区域（≧400 nm），这使得这类染料更加适用于活细胞超分辨成像。将连接有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活性酯的荧光开关染料标记处于酸性环境（pH 4.5）中的枯草芽孢杆菌表面，最终通过超分辨显微成像系统得到细胞表面的三维超分辨图像。取得了一系列有影响力的研究成果，发表4篇SCI论文，包括1篇JACS, 1篇Chem. Sci., 1篇Chem. Commun., 1篇Chin. Chem. Lett., 申请专利10项。