GPR40介导的团头鲂beta细胞胰岛素分泌及脂性凋亡的调控机制

G protein-coupled receptor (GPR40) is a specific free fatty acid receptor expressed in islet beta cells. It is activated by long-chain or medium-chain fatty acids and implicates in mediating physiological effects on islet. In this research, we will study GPR40 molecular cloning and its physiological role in insulin secretion and lipoapoptosis of islet cells in Megalobrama amblycephala in vitro. Full-length cDNA sequences of GPR40 will be identified using RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE). Tissue distribution will be investigated using quantitative reverse transcription PCR. The effects of different level glucose and free fatty acid on insulin secretion, the gene expression of GPR40, cell viability and apoptosis by ERK1/2 signalling pathway will be evaluated using small interference RNA (siRNA)technology and vector transfer methods. Insulin secretion, cell viability and apoptosis are detected by radioimmunoassay, MTT assay and flow-cytometry analysis, respectively. Phosphorylation of ERK1/2 is tested by Western-blot method. Cell membrane surface GPR40 localization is analyzed by immunohistochemistry. The results obtained here may illustrate the mechanisms of the lipid and glucose utilization and provide useful probe for further exploring low-protein / high-calorie diet in this fish and other herbivorous freshwater species culture.

G蛋白偶联受体 40（G protein-coupled receptor 40）是中长链游离脂肪酸特异性受体。脂肪酸可通过该受体调控胰岛β细胞胰岛素的分泌。本项目以GPR40为靶标，分别应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术和实时荧光定量PCR技术克隆团头鲂GPR40的全长基因序列及组织中的差异性表达，构建GPR40 cDNA文库和组织表达图谱。利用体外培养的胰岛β细胞，应用免疫放射、荧光实时定量PCR及免疫化学方法检测不同浓度脂肪酸和葡萄糖对细胞胰岛素分泌、GPR40表达量和其在细胞膜表面的表达定位。应用siRNA技术抑制细胞膜GPR40的表达，探讨GPR40对β细胞胰岛素分泌和细胞脂性凋亡的调控作用以及GRP40如何通过ERK1/2途径参与细胞凋亡的调控过程，为研究团头鲂糖和脂肪利用及其引起的营养代谢障碍提供新的思路和研究方法，也为团头鲂高能低蛋白日粮的开发提供理论依据。

项目组根据计划书要求，以团头鲂为模式动物，应用高脂诱发鱼类营养性脂肪肝，比较分析了哺乳动物和鱼类在脂肪和糖代谢紊乱情况下机体生理指标的差异，以调节脂肪代谢为研究切入点，以G 蛋白偶联受体为靶标，借鉴哺乳动物的相关研究方法， 探讨G 蛋白偶联受体介导脂肪酸对细胞脂肪代谢和细胞脂性凋亡的调控作用以及其信号调控通路，为研究团头鲂糖和脂肪利用及其引起的营养代谢障碍提供新的思路和研究方法，也为高能低蛋白饲料的开发提供科学依据。项目按照原计划书内容实施，具体开展以下几方面的工作：1. 团头鲂GPR43 基因克隆及其组织表达差异性分析。2.黄连素介导p38对高脂诱导的团头鲂GPR43基因mRNA表达量的影响。3. 黄连素对游离脂肪酸诱导的淡水鱼类肝细胞氧化应激、细胞凋亡及脂肪沉积的影响。 此外，项目在原计划书的基础上，根据实际试验进展和结果对原计划书以外内容试做了必要的延伸工作，包括1. 团头鲂微管相关蛋白轻链3(LC3B)基因克隆及组织分布。2. 黄连素不同投喂模式对团头鲂生长、氧化应激和免疫性能的影响。这部分工作是本项目内容以外延续性探索，不仅在能从分子机制上更好的解释鱼类营养性脂肪过量沉积原因。.项目组超额完成计划书内容，在水产营养及生理生化高水平SCI期刊上共发表研究型论文4篇，中文核心期刊2篇（见成果附录）。培养青年优秀科研人员2名（晋升为副教授），博士2名（已毕业），硕士2名（现已为在读博士研究生）。