油菜抗乙酰乳酸合成酶类除草剂的分子基础

种植抗除草剂油菜具有节本、增效、促进水土保持等诸多优点，但迄今我国尚无获准商业化种植的抗除草剂油菜，关键是缺乏自主知识产权的抗性基因。本项目以甘蓝型油菜抗乙酰乳酸合成酶（ALS或AHAS）类除草剂突变体M9为材料，应用同源序列法克隆油菜ALS家族基因BnALS1～3，探明M9突变发生的基因及位点；对突变基因进行原核表达，研究ALS突变前后的酶学特性以及ALS与除草剂的作用机制，并构建植物表达载体转化拟南芥进行功能互补验证，解析产生抗性的分子基础，获得具有自主知识产权的抗除草剂基因；以该基因的DNA序列开发分子标记，建立快速、高效的分子检测体系，为抗除草剂油菜育种提供基因标记和选择方法。这些研究对丰富我国油菜特异种质资源，选育不受环境释放限制的抗除草剂油菜新品种具有重大的理论和现实意义。

乙酰乳酸合酶（ALS或AHAS）抑制剂类除草剂共包括五大类化合物：咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑嘧啶磺酰胺类、嘧啶水杨酸类和磺酰氨羧基三唑啉酮类，具有超高效、低毒、杀草谱广和对环境友好等众多优点。本课题组在油菜和大豆多年轮作的试验田中发现了自然突变的抗咪唑啉酮油菜M9，该突变体抗性是由单个核基因控制的显性性状。本项目以M9为材料，利用PCR克隆到油菜ALS家族基因BnALS1～3，序列比对发现，M9抗性是由BnALS1基因的点突变使蛋白序列的638位丝氨酸（AGT）残基被天冬酰胺酸（AAT）替代所致，将此抗性基因命名为BnALS1R。构建抗性基因BnALS1R的植物表达载体，转入拟南芥。除草剂抗性鉴定表明，15株转基因阳性植株具有咪唑啉酮抗性，而非转基因植株不具有除草剂抗性，证实BnALS1基因的点突变（Ser638Asp）是抗性产生的分子基础。Real-time PCR结果表明，BnALS1突变后在野生型和突变体的表达水平无显著差异，但突变体的BnALS3表达水平是野生型的2倍。原核表达结果表明，抗性基因BnALS1R能在大肠杆菌中表达，纯化获得油菜ALS1突变酶S638N。酶学研究发现，突变酶S638N对温度和pH的响应与野生型相同，表现在37oC、pH 7.0条件下催化活性均达到最高。该突变酶的酶学动力学性质及其对3个辅助因子的响应曲线与野生型相同，缺少任何1个辅助因子S638N基本都没有活性，但却具有对咪唑啉酮的专一抗性。根据抗性基因与野生型基因的SNP设计30条AS-PCR引物，筛选得到一种检测抗性基因BnALS1R的三引物分子标记，该标记可以区分出抗性基因的3种基因型。. 以上研究结果先后在《中国农业科学》、《作物学报》、《Molecular Breeding》等杂志发表，受到国内外评审专家好评。通过该项目实施，共发表研究论文4篇，获得国家发明专利授权2项，培养硕士研究生2名，超过项目预期目标。