日本看麦娘抗乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的分子机制研究

杂草对化学除草剂产生抗性的分子机制研究对阐明植物选择性作用机理、植物产生抗药性的机制、科学合理施药、创制新农药及发掘优质的抗性基因具有重要意义。本项目拟从不同抗性水平的日本看麦娘种群中获得抗乙酰羟酸合酶（AHAS或ALS）抑制剂类除草剂的AHAS大小亚基基因，与GenBank的AHAS在氨基酸顺序水平上进行比对分析，确定克隆的AHAS基因的同源性,将获得的AHAS进行酵母中的表达、纯化和功能验证，明确克隆得到抗性AHAS的突变位点；通过抗性基因上关键位点进行点突变，分析杂草AHAS基因突变与杂草对AHAS类除草剂产生抗性的对应关系，验证各位点发生改变前后ALS的酶活及对除草剂抗性强度变化，并在拟南芥中进行表达验证，可筛选出高抗、抗药谱宽的优质基因。对比分析AHAS在杂草体内调控表达水平的变化,更能够全面阐明AHAS与药剂的相互作用机制，可能为创制新化学物质开辟一条捷径，有着广阔的研究前景。

乙酰羟酸合酶（AHAS）是植物、真菌和细菌细胞内必需的支链氨基酸生物合成的关键酶，是AHAS抑制剂类除草剂的作用靶标。经过本项目的实施，筛选得到了抗磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶磺酰胺类与嘧啶水杨酸类这四大类AHAS抑制剂类除草剂的日本看麦娘抗性生物型， 对AHAS抑制剂类除草剂具有明显的交互抗性，其中参试材料对磺酰脲类除草剂的抗性指数为894.6-1220.7，抗性最高；对嘧啶水杨酸类的抗性指数为75.2；对咪唑啉酮类与三唑嘧啶磺酰胺类的抗性介于前面两大类除草剂之间。利用PCR技术分别从日本看麦娘抗感品系中分离得到AHAS大亚基基因，经比对分析发现：其抗性生物型AHAS大亚基有2个氨基酸位点发生突变(Ser222→Asn222, Gly230→Asp230)。将日本看麦娘抗感品系的AHAS大亚基基因分别转入酵母中进行表达，测得抗性转化子的表达产物对各类AHAS抑制剂类除草剂具有较强的抗性，其结果与日本看麦娘抗性生物型抗性水平基本一致，并且抗性表达产物的纯化酶活性为7.3 U/mg，高于敏感1.9 U/mg，表明日本看麦娘AHAS大亚基氨基酸位点突变是杂草对乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂产生抗性的原因，同时也是新发现的AHAS突变位点。应用重叠延伸PCR方法，将克隆的抗性乙酰羟酸合酶基因AHAS的两个碱基位点进行定点突变，改变基因序列存在的酶切位点--BamHI酶切位点与KpnI酶切位点，并且在目的基因的5’端和3’端两端分别连接BamH I和Kpn I酶切位点。将改造好的目的基因与植物表达载体pVec-8Ubi连接，构建水稻过表达载体pVec-ahas，用农杆菌接介导法，将抗性日本看麦娘源乙酰羟酸合酶基因ahas导入到模式植物水稻--水稻粳稻品种日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare），经潮霉素抗性筛选获得了30株再生幼苗。经PCR验证、RT-PCR检测与室内供试AHAS抑制剂类除草剂处理，研究表明项目目的ahas基因已成功转入水稻日本晴，并且日本晴获得了对AHAS抑制剂类除草剂较高水平的抗性。项目实施的结果，初步阐明了农田杂草日本看麦娘对AHAS抑制剂类除草剂产生抗性的分子机制，可能为创制新化学物质与抗除草剂作物品种的培育开辟一条捷径，有着广阔的应用前景。