EGCG-铜配位修饰干细胞增强促血管生成作用的机制研究

The incidence of lower limb ischemia disease increased gradually, seriously affecting the quality of patients’life. Our previous researches confirmed that treatment of angiogenesis with stem cells is effective on mice, but the application in clinical practice did not gain ideal effect, which is due to the low survival rate of stem cells transfection in vivo. With EGCG-copper coordination-stem cell surface engineering technology, stem cells will be protected by the outer semipermeable membrane barrier to maintain cell function. EGCG anti-inflammatory and anti-oxidation are conducive to the improvement of ischemic microenvironment and reconstruction of microvascular, and copper ions can promote the generation of blood vessels and remove excess H2O2. The concentration of H2O2, the inflammatory cytokines and the changes of copper ions will be tested in clinical cases to figure out the potential relationship between the quantity of copper ions and the number of collateral vessels. Stem cells modified by previous methods will be cultured together with SMC, IW and EC cells in vitro to evaluate the inhibition of EGCG on inflammatory factors such as IL-6 and TNF-a and the regulation of copper ion in the CTR1-ATP7A signaling pathway, both of which clear H2O2 to achieve the responsiveness of ROS, to enhance the pro-angiogenic effect. Finally, it will be validated in the mouse limb ischemia model. The purpose is elucidating that this technology can play multiple functions of “protection of stem cells, improvement of ischemic microenvironment, and material synergistic angiogenesis”, it provides a new strategy for stem cell treatment of ischemic diseases of the lower extremities.

下肢缺血发病率逐年提高，严重影响患者生活质量。我们前期研究及文献均证实干细胞治疗性血管生成初步有效，但临床应用并不理想，主要原因是体内干细胞转染成活率低。本课题采用EGCG-铜配位-干细胞表面工程化技术，通过外层半透膜屏障保护干细胞且维持细胞功能，利用EGCG抗炎抗氧化作用改善缺血微环境，发挥铜离子促血管生成作用并清除过量H2O2。通过临床病例检测H2O2浓度、炎症因子及铜离子水平，分析铜离子与侧枝血管数量的关系。沿用既往方法修饰干细胞后，在体外与SMC、IW及EC细胞共培养，评估EGCG抑制IL-6、TNF-a等炎症因子及铜离子上调CTR1-ATP7A信号通路的作用，及两者对H2O2清除实现ROS响应性的效果。最后在小鼠后肢缺血模型中验证分子机制及促血管生成的效果。希望阐明该技术发挥“屏障保护、缺血微环境改善、材料协同促血管生成”的多重作用及机制，为下肢缺血性疾病的干细胞治疗提供新策略。

下肢缺血发病率逐年提高，严重影响患者生活质量。我们前期研究及文献均证实干细胞治疗性血管生成初步有效，但临床应用效果欠佳。因此本项目主要围绕下肢缺血疾病治疗性血管生成进行生物材料功能性载体的研发。同时在研究过程中发现下肢微小血管成像及定量困难的问题以及临床数据库和标本库的重要性，因此也对此两方面的研究内容做了拓展。首先，重点围绕金属多酚配位微囊的研发，采用绿茶提取物（EGCG）与Cu离子配位；利用EGCG抗炎、抗氧、清除H2O2改善缺血微环境；发挥Cu离子协同促血管生成作用。通过SEM、ICP、Amplex Red进行微囊形态及功能表征。通过细胞实验，分别评估制剂的细胞毒、抑炎、促细胞迁移等作用。最后构建小鼠下肢缺血模型，通过免疫组化、ELISA、Western Blot及RT-PCR进一步验证其促血管生成效果。接着，为了进一步证实该金属多酚微囊具有良好的可修饰，我们又制备了EGCG-Zinc配位微囊，进一步证明了该技术可发挥“屏障保护、微环境改善、材料促血管生成”的多重作用实现更佳的促血管生成效果，是新一代功能性载体。其次，我们采用上述研发的EGCG-Cu配位微囊技术用于细胞的包载，分成从SMC、干细胞、M2细胞进行尝试；已初步掌握了浓度、条件及细胞试验和动物试验的验证。通过金属多酚的涂层修饰以提高细胞对于病理微环境的抵抗能力，增强其抗性，进而发挥细胞的促进组织修复的能力。此外，我们开发了OCTA的血管成像技术并应用于小鼠缺血肢体治疗性血管生成的评估，并初步证实Cu离子具有促血管生成的作用，并且完成下肢缺血疾病临床数据库的构建（600余例患者）及标本库的初步构建（200余份）。本项目研究顺利，共发表高水平文章5篇，申请发明专利3项，获奖省部级及院级奖2项，博士研究生培养3人次，拓展新课题思路1项。综上所述：我们成功构建了一种具有ROS清除作用的微囊，该微囊能明显改善小鼠下肢缺血的情况，同时该微囊也可作为细胞/药物递送载体，为后续药物、基因及蛋白等具有治疗作用物质的递送奠定了基础，为下肢缺血疾病的治疗性血管生成提供了新策略。