谷氨酸受体和转运体在NSSR1参与缺血性神经损伤保护中的作用及机制研究

Glutamate induced excitotoxicity is an important mechanism which leads to ischemic neuronal injury. The glutamate receptors located on the neuronal membrane and the glutamate transporters located on the astrocytic membrane are the two major factors that affect the excitotoxicity. The expression of both proteins is subject to pre-mRNA splicing regulation, producing multiple isoforms with different functions. However, the regulation mechanism is unknown. The results of our previous studies suggest that pre-mRNA splicing factor NSSR1 might reduce the excitotoxicity neuronal injury induced by cerebral ischemia via regulating the alternative splicing of GluR-2 subunit of AMPA receptor, glutamate transporters GLAST or GLT1. In the proposed project, molecular biological, histochemical and electrophysiological analyses will be comprehensively used to investigate the protective function and mechanism of NSSR1 in ischemic brain. The transient global cerebral ischemic model of NSSR1 conditional knockout mice, and the oxygen-glucose deprivation model (OGD) or glutamate stimulated model of cultured hippocampal neurons or astrocytes will be used. The expression level of the GLAST and GLT1 isoforms, the glutamate-transporting ability of the GLAST and GLT1 in astrocytes, the expression level of the GluR-2 isoforms, the electrophysiological characteristics and the ability of calcium response of the AMPA receptor in neurons will be characterized to determine the differences between the NSSR1 conditional knockout mice and the control mice. The results will provide molecular basis for understanding the mechanism underlying the protective function of NSSR1 against ischemic neuronal injury.

谷氨酸兴奋毒是脑缺血导致神经元损伤的一大主要机制。存在于神经元细胞膜上的谷氨酸受体和胶质细胞膜上的谷氨酸转运体，是影响兴奋毒性的两大关键因素。两类蛋白的表达都受前体mRNA剪接调控，产生功能不同的亚型，但其调控机制尚不清楚。我们的前期研究提示，剪接因子NSSR1 可能通过调控谷氨酸转运体GLAST或GLT1，或AMPA受体的GluR-2亚基的基因转录或亚型剪接来降低脑缺血引起的兴奋毒性神经元损伤。本项目将综合利用分子生物学、组织化学和电生理检测等方法，利用NSSR1条件性敲除小鼠的脑缺血模型，以及离体培养的小鼠海马星型胶质细胞或神经元氧糖剥夺（或谷氨酸刺激）模型，通过比较NSSR1基因敲除前、后的海马星型胶质细胞上GLAST和GLT1的亚型表达和转运功能、以及神经元上GluR-2的亚型表达及AMPA受体的电生理特性和钙离子通透性的差异，来探讨NSSR1参与缺血脑内神经保护的功能和机制。

谷氨酸兴奋毒是脑缺血导致神经元损伤的一大主要机制。存在于神经元细胞膜上的谷氨酸受体和胶质细胞膜上的谷氨酸转运体，是影响兴奋毒性的两大关键因素。本项目在已有研究的基础上，从谷氨酸兴奋毒性调控的角度，研究了前体mRNA剪接蛋白NSSR1在脑缺血后对海马神经元的保护作用及机制，结果显示：（1）在星形胶质细胞中敲除NSSR1，可以抑制脑缺血引起的小鼠海马各区谷氨酸转运体 GLT-1、GLAST mRNA和蛋白水平表达的上调，并可以抑制脑缺血引起的GLT-1的 variant 1 和3 剪接亚型的增加。同时，脑缺血引起的星形胶质细胞中神经营养因子BDNF的表达的上调也受到抑制。提示脑缺血后，海马星形胶质细胞中 NSSR1的表达上调，可能通过调控谷氨酸转运体的转录和剪接来影响其表达和功能，也可能通过抑制星形胶质细胞表达和分泌 BDNF，从而起到脑缺血后神经保护的作用。（2）在神经元中敲除 NSSR1，尽管对海马AMPA谷氨酸受体 GluR-2 亚基的Flip/Flop等亚型的剪接比例无显著的影响，但可以显著降低GluR-2 的mRNA和蛋白水平。提示，脑缺血后，神经细胞中NSSR1表达的改变，可能通过影响谷氨酸受体亚基的表达来影响其功能。（3）此外，在神经元中敲除 NSSR1，可以引起小鼠海马组织中神经特异性的转录抑制因子NRSF的mRNA和蛋白水平的显著降低、以及凋亡相关基因Bcl-2和Traf3或其亚型表达的改变。结合我们之前的NSSR1对缺血后神经元具有保护作用的实验结果，提示NSSR1在谷氨酸引起的神经元损伤和凋亡中、以及在神经发育过程中，具有调控作用。（4）此外，我们还对谷氨酸毒性导致R28视网膜神经细胞铁离子依赖的死亡模式、以及AMPA及NMDA谷氨酸受体在其中的可能作用进行了探究。鉴于神经营养因子在神经元损伤及修复中的重要作用，在执行原计划要点的同时，我们还适当拓展了神经营养因子cpg15在脑缺血损伤、谷氨酸毒性和氧化应激引起的神经细胞损伤中的作用和机制等的研究。