趋化因子IL-8在蝾螈断肢再生过程中的作用探讨

Limb regeneration after injury has been a difficult and hot research point in medicine. Effective regulation of the proliferation of endogenous stem cell and the induction of normal cells dedifferentiation and transdifferentiation is the key of regeneration. Amphibian animal salamander has the capacity to regenerate limbs. Studies confirmed that the immune system in the salamander limb regeneration, especially macrophages have very important role in the early stage. But the signals to start macrophage recruitment to sites of damage are absent so far. We found the expression of IL-8, a cytokine with strong chemotactic effects on macrophages, had close relationship with limb regeneration by analysis of the regenerated tissue from broken limbs in different time after transcriptome sequencing. When IL-8 specific siRNA was injected into limb parts, it’s found limb regeneration was significantly inhibited. In this study, the secretion sources, expression pattern and localization of IL-8 will be analyzed in the salamander limb regeneration model within the different time period. Meanwhile, chemotaxis of IL-8 on macrophages and mesenchymal stem cell will be validated both in vitro and in vivo. phenotype recruited cells, function, change of downstream signaling pathways and regeneration related gene expression changes will be discussed as well. This project aims to reveal the mechanism of regulation of the immune system in the regeneration process and provides new ideas and direction for mammalian limb regeneration research and application.

外伤后的肢体再生一直是医学的难点和研究热点，有效地调节内源性干细胞的增殖分化及诱导正常细胞去分化和转分化是再生的关键。两栖动物蝾螈具有强大的肢体再生能力，研究证实免疫系统在蝾螈肢体再生中，尤其是巨噬细胞在早期阶段有不可或缺的关键作用。但是对启动巨噬细胞募集至损伤部位的信号，至今一无所知。我们对不同时间离断肢体部位的再生芽基组织进行转录组测序后发现，对巨噬细胞具有强烈趋化作用的细胞因子IL-8的表达与肢体再生关系密切，在离断肢体部位输入IL-8特异性siRNA后，肢体再生明显被抑制。本课题拟在蝾螈断肢再生模型中分析各时间段IL-8在再生肢体中的来源、表达模式及定位变化；同时在体内外验证IL-8对巨噬细胞和间充质干细胞趋化作用；分析被募集细胞的表型、功能、下游信号通路变化及再生相关基因的表达变化。本项目旨在揭示免疫系统在再生过程中的调控机制，将为哺乳动物的肢体再生研究和应用提供新的思路和方向。

外伤后的肢体再生一直是医学的难点和研究热点。有尾两栖类动物蝾螈，具有独特而强大的再生能力，是研究肢体再生过程中的理想模型。以东方蝾螈截肢后不同再生时间点的再生肢体组织为研究对象，建立东方蝾螈肢体再生模型。再生转录组数据，筛选出肢体再生过程中差异表达的关键转录因子，并通过qPCR进行验证。在再生过程中发生显著改变的基因大部分与细胞进程、生物调节、发育和免疫系统等密切相关。东方蝾螈肢体再生的蛋白表达谱发现异表达的蛋白与代谢、伤口愈合、细胞过程蛋白、结合和免疫反应有关。对肢体再生中的miRNA进行发掘分析，对所有差异表达的miRNA进行了靶基因预测；功能分析表明，这些差异表达的蛋白与代谢、伤口愈合、细胞过程蛋白、结合和免疫反应有关。肢体再生过程中的microRNA组学研究表明，差异表达的miRNA靶点主要针对细胞骨架重构和碳水化合物代谢。. 同时，巨噬细胞对肢体早期再生过程至关重要，但是IL-8启动巨噬细胞募集至损伤部位的作用未明。我们克隆出蝾螈IL-8基因开放阅读框共306bp，可编码101个氨基酸。诱导表达IL-8融合蛋白，制备蝾螈IL-8多克隆抗体，观察蝾螈肢体再生不同时间点IL-8在核酸水平的表达变化和分布，发现IL-8 mRNA 在肢体再生早期有明显的上调，随着伤口愈合IL-8表达量逐渐下调，直到肢体再生14dpa（day post amputation）恢复到正常水平，IL-8 mRNA表达主要集中分布在肢体截肢部位处。随后利用IL-8多克隆抗体，观察肢体再生不同时间点IL-8在蛋白水平的表达变化及分布，通过Western Blot 结果显示在蝾螈断肢后，IL-8蛋白表达量持续升高，在再生3dpa时达到峰值，直至再生14dpa左右IL-8蛋白的表达逐渐恢复到正常基线水平，利用荧光免疫组织染色技术在肢体再生早期伤口处检测到大量IL-8阳性细胞。