Actin，RACK和GAPDH在灰飞虱传播RBSDV过程中的作用

RBSDV is transmitted via Laodelphax striatellus(the small brown planthopper, SBPH) in a persistent, circulative manner. It causes rice black streaked dwarf disease and maize rough dwarf disease which result in great losses. In previous research, we found that three proteins actin,receptor for activated C kinase (RACK) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in SBPH could interact with RBSDV outer coat protein P10 and combine with virus particles. The biological significance of the interaction in the circulative process is still unknown. To study the function of these proteins in the virus circulative process, we propose to use the methods such as pull down to clear whether these three proteins work in complex form, use immunefluorescence staining method to clear the protein distribution and whether they were co-located with RBSDV in SBPH, use dsRNA interfere and antibody feeding method to clear whether they were involved in virus transmission, and analyze the transmission ability and the expression of these three proteins in the different instars of SBPH to find out whether there is a correlation between the expression of these proteins and the virus transmission ability of SBPH. The results are expected to acquire the vector factors which are involved in virus transmission, and to promote the understanding of the virus transmission mechanisms via SBPH.

水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）通过灰飞虱以持久循回方式传播,引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病等病害，造成严重危害。前期研究发现，灰飞虱肌动蛋白（actin）,激活的蛋白激酶C受体（RACK）和三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）能与RBSDV外壳蛋白P10互作，并且可结合病毒粒子，但这3个蛋白在病毒循回过程中的作用不清楚。本项目拟采用pull down等方法分析3个蛋白是否以复合体形式与病毒互作；采用免疫荧光标记等方法明确三者及RBSDV在介体内的组织定位；通过dsRNA干扰和抗体饲喂等方法分析三者是否是灰飞虱传RBSDV必需的介体因子；采用qRT-PCR等方法对比分析不同虫龄灰飞虱传播RBSDV能力与这3个基因表达的相关性，明确三者与介体传毒能力的关系，最终阐明三者在灰飞虱传RBSDV过程中的作用。研究结果对揭示灰飞虱传播RBSDV的关键介体因子和阐明灰飞虱传毒机制具有重要意义。

水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）通过灰飞虱以持久循回方式传播，引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病等病害，造成严重危害。前期研究发现，灰飞虱肌动蛋白（actin），激活的蛋白激酶C受体（RACK）和三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）能与RBSDV 外壳蛋白P10互作，并且可结合病毒粒子，但这3个蛋白在病毒循回过程中的作用不清楚。本项目克隆了这三个蛋白，分别进行了原核表达和蛋白纯化，并制备了多克隆抗体；分析了1-5 龄灰飞虱带毒率差异及RACK基因的表达量，发现 2 龄灰飞虱中RACK的表达量最高，而3 龄灰飞虱的带毒率最高，表明RACK的表达量与灰飞虱获毒能力没有相关性。采用饲喂dsRNA的方法干扰了RACK基因，发现RACK干扰后灰飞虱的带毒率增加，表明RACK负调控病毒的侵染。.采用荧光定量PCR分析了内参候选基因actin，GAPDH，α-Tublin，β-Tublin，18s rRNA，RPL8和RPL5的稳定性，结果发现不同龄期灰飞虱中RPL5表达最稳定，而在不同组织中α-Tublin的表达均最稳定。感染RBSDV或RSV的灰飞虱中RPL8的表达最稳定。当采用RNAi干扰灰飞虱基因后使其获取病毒时，β-Tublin为最适内参。研究结果对灰飞虱中采用荧光定量PCR进行基因表达量分析时的内参基因选择具有指导意义。.RBSDV除可侵染传播介体灰飞虱外，还可侵染多种植物寄主，如水稻，小麦和玉米等。不同植物寄主感染RBSDV的症状略有不同。本研究分析了RBSDV在不同寄主中病毒基因组的表达情况，发现P10在植物寄主中表达量最高，而在昆虫中P7-1的表达量最高，研究结果对解析病毒在不同寄主中的致病机制提供了线索.灰飞虱卵在水稻上产于叶鞘等部位，较难观察到卵的发育，本研究构建了灰飞虱卵的显微注射和人工孵化体系。采用人工孵化体系则可随时观察卵的发育情况，因此该体系对灰飞虱卵的发育研究具有重要意义。目前，灰飞虱上基因敲除体系尚未建立，灰飞虱卵人工孵化和显微注射体系的构建为灰飞虱基因敲除技术奠定了基础。