水稻中与RBSDV致病性相关寄主因子的筛选及鉴定

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)在病毒粒子形态、传毒介体、危害特性、基因组序列和功能等方面已有较深入的研究，但病毒与水稻的互作机制还不清楚，与病毒致病性相关的寄主因子未见报道，斐济病毒属其他病毒也未有类似研究。本研究拟采用基于双向电泳的蛋白质组学技术，分析RBSDV侵染前后水稻蛋白质组差异，分离差异表达的蛋白，并通过质谱进行差异表达蛋白鉴定。双向电泳筛选获得的差异表达蛋白采用real-time PCR和western blot进行表达量差异的验证。为明确所获得的差异表达蛋白在RBSDV致病性中的作用，进一步采用RNAi方法对差异表达蛋白的基因功能进行分析，筛选获取与RBSDV致病性相关的寄主因子。本研究对阐明RBSDV致病机制及其与水稻的互作机制具有重要意义，对揭示斐济病毒属的致病机理必将起到推动作用，并为利用寄主因子控制水稻黑条矮缩病提供理论依据。

目前水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarf virus, RBSDV）与水稻的互作机制还不甚清楚。水稻感染RBSDV后造成植株矮小，叶片僵直，出现瘤状突起等症状。病毒侵染水稻后对寄主植物产生了哪些影响及水稻中哪些寄主因子参与了病毒的致病过程还有待分析。研究采用蛋白质组学方法分析了RBSDV侵染后水稻蛋白质组的变化。结果显示，RBSDV侵染后水稻中72个蛋白差异表达，其中69个差异表达蛋白通过MALDI-TOF/TOF-MS成功进行了鉴定。这些差异表达蛋白主要涉及防卫反应，氧化还原，碳代谢，核酸代谢，植物激素反应，光合作用，信号传导，转录和翻译等13个过程。进一步采用real time PCR方法验证了部分差异表达蛋白在mRNA表达水平的差异，结果与蛋白质水平的变化趋势相一致。蛋白质组学分析结果表明有21.7%的差异表达与光合作用相关，且其中大部分蛋白表达量下降，为进一步验证RBSDV对水稻光合作用的影响，我们测定了水稻感染RBSDV后光合参数的变化，结果显示，光合作用速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率均显著下降，说明病毒侵染后水稻的光合作用受到抑制。以上研究结果从蛋白质组水平阐明了RBSDV对水稻的影响。蛋白质组分析结果表明水稻核糖核酸酶3在病毒侵染后特异性表达。Real time PCR分析结果表明，RBSDV侵染玉米，小麦和水稻时，寄主植物的核糖核酸酶基因的表达量均上调。为研究此基因功能，我们构建了水稻核糖核酸酶3的过量表达载体和RNAi载体，并转化水稻，获得了T0代转基因植株，但其功能有待于获得T1代植株进行深入分析。此外，RBSDV侵染后水稻过氧化氢的含量增加。为进一步分析过氧化氢在RBSDV与水稻互作过程中的作用，我们将水稻在过氧化氢处理后差异表达的蛋白与RBSDV侵染后差异表达蛋白进行了比较分析，发现在RBSDV侵染后差异表达的蛋白中，有19个蛋白对应与37个差异表达蛋白点同时也在过氧化氢处理后差异表达。这些在过氧化氢和RBSDV侵染条件下均差异表达的蛋白主要涉及光合作用、氧化还原、代谢、能量和细胞壁修饰。RBSDV侵染后过氧化氢含量增加有可能导致在水稻体内参生氧化胁迫，导致光合作用减弱，正常代谢被扰乱，并最终导致植物生长异常。研究结果对过氧化氢在RBSDV与水稻互作过程中的作用有了新的认识。