龟鳖抗氧化防御系统应激响应的整合生物学研究

动物的抗氧化防御系统在清除活性氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，抗病、抗衰老等方面发挥着重要功能。乌龟和中华鳖是我国重要经济种类，历来被视为长寿的象征，其抗氧化防御系统是否具有独特性值得期待。另一方面，集约化龟鳖养殖经常因环境胁迫造成动物生理机能受损而蒙受损失，但有关龟鳖抗氧化系统应激响应的整合性分子水平研究仍是空白。本项目拟探讨如下科学问题：⑴龟鳖转录因子Nrf2基因和受其调控的下游SOD、CAT、GPX酶基因的表达模式以及非酶抗氧化系统随年龄的变化？⑵ 龟鳖酶类抗氧化系统与非酶类抗氧化系统在应激响应过程中存在怎样的相互作用？（3）不同胁迫水平下龟鳖Nrf2基因及其下游抗氧化酶基因表达模式的变化及其与非酶系统小分子抗氧化剂的关系？（4）外源小分子抗氧化剂对龟鳖抗氧化系统应激响应及其调控会产生怎样的影响？研究成果可为爬行动物应激生理学及龟鳖养殖提供基础数据和理论指导。

抗氧化防御系统在清除自由基，保护组织免受氧化损伤，抗病、抗衰老等方面具有重要功能。淡水龟鳖类以耐胁迫和长寿著称，其抗氧化防御系统是否具有独特性值得期待,但该方面的系统研究却很缺乏。本项目对淡水龟鳖抗氧化防御系统的应激响应模式在不同水平上进行了整合生物学探讨，主要研究内容及结果如下：1 克隆了中华鳖和乌龟抗氧化防御关键酶Nrf2、SOD1、SOD2、CAT和GPx1、GPx3、GPx4的cDNA全长序列，并以此为基础进行了系统发育和基因结构分析，发现龟鳖与红原鸡相似性最高，确定了这些关键酶蛋白的功能结构。2检测了鳖、龟抗氧化防御关键酶基因在肺、肠、肌、心、脾、肾、脑和肝8组织中的mRNA表达模式、总酶活性、MDA水平及其受年龄、性别的影响。发现所有基因在8组织中均表达，但表达模式和酶活具有组织特异性，肝、肾基因表达和酶活水平相对较高；年龄、性别对鳖抗氧化系统和组织MDA影响不明显。肝组织 N rf2 mRNA表达雄龟不受年龄影响，而成年雌龟显著高于幼龟和成年雄龟；SOD总酶活成年雄龟显著大于幼、稚龟，雌龟SOD不随年龄变化；CAT基因表达成龟显著低于幼、稚龟，雄显著低于雌；GPx4基因表达雄性稚龟显著高于成龟，成龟雌显著高于雄。CAT和GPx总酶活及MDA水平不受年龄、性别影响。3 观测了幼龟、鳖28度到15度下冷暴露8小时、1天、5天及15天抗氧化酶系统的变化。乌龟在基因表达和酶活水平均未发现明显变化，组织无损伤；鳖酶活及MDA水平未受影响，但各抗氧化酶基因表达随冷暴露时间延长表现出不同的组织特异性变化。4进一步克隆测序了中华鳖谷胱甘肽合成酶各亚型基因、GR(谷胱甘肽还原酶)和谷胱甘肽转移酶各亚型基因，系统观测了急性高强度冷、热应激对中华鳖抗氧化酶系统与小分子抗氧化剂Vc系统的影响。急性冷热应激均未使Nrf2基因表达发生显著变化，但其调控的下游抗氧化酶基因表达出现组织特异性变化，酶活力整体维持较高水平；小分子抗氧化剂Vc系统在抗氧化防御中发挥着重要作用。5 系统观测了稚、幼鳖冬眠过程中抗氧化防御系统的变化，发现冬眠前鳖各组织Vc含量明显上升，冬眠中Vc消耗明显，特别是脾脏，出眠后Vc水平恢复；抗氧化酶基因表达呈现组织特异性，总SOD酶活降低，冬眠过程抗氧化损伤不明显。6 观测了中华鳖幼鳖急性冷暴露再恢复过程中脑、肝、肾组织的表达谱。