物理加工效应对芸豆凝集素结构与活性影响的机理研究

芸豆凝集素（PHA）是一种糖蛋白，近来研究发现PHA具有抗HIV-1病毒活性，引起人们高度关注。本项目拟采用不同强度的物理加工技术（超声、高静压或超高压微射流均质处理等）对芸豆进行处理，对其所含凝集素PHA进行有效的分离纯化，借助光谱、质谱等先进手段对PHA的糖链结构（糖链中单糖组成及分子比例、糖链分子质量、糖链连接次序、糖环构象、糖肽键类型等）及蛋白链结构（亚基组成、一级氨基酸序列、二级结构等）进行表征，并追踪研究不同结构状态下PHA的生理活性（红细胞凝集活性、糖结合专一性、对CD4+ T淋巴细胞的增殖活性等）的变化，阐明PHA的构效关系。同时，构建体外模拟消化道体系，以抗体特异结合ELASI法研究不同加工处理前后PHA对人消化道酶系（胃蛋白酶、胰蛋白酶）的耐受情况变化，阐明PHA的消化动力学作用机制，以期为糖蛋白复合物的研究提供参考信息。

本项目共完成五大部分工作：第一，研究了不同加工预处理技术对芸豆凝集素(PHA)得率及活性的影响。发现芸豆先匀浆后浸提工艺所得PHA粗品活性较强；超声预处理(料液比1:15、功率325 W、时间20 min)可显著增强PHA粗品的得率和血凝活性。普通均质作用不能显著改变PHA粗品得率，但大于40MPa的均质压力下循环两次导致PHA凝集效价降低一个单位。第二，研究了超高压处理对芸豆匀浆液中PHA结构和活性的影响。超高压(50、150、250、350及450 Mpa)处理红芸豆匀浆液后提取PHA，发现PHA粗品得率随压力增大而增加，但超过250MPa将PHA血凝活力降低。经Affi-gel blue gel纯化后，PHA凝集效价有较大提高。SDS-PAGE分析发现450MPa处理导致PHA分子亚基条带交联，后经体积排阻色谱(SEC)分析进一步证实该假设。红外扫描光谱(FTIR)分析表明，超高压处理使PHA二级结构由α螺旋向β折叠、β转角转变，结合热力学(DSC)分析证实，超高压处理使PHA四聚体蛋白分子结构发生了不同程度的解离和聚合，从而改变其血凝活性。第三，研究了超高压处理对纯化后的PHA结构和活性的影响研究。先将PHA从芸豆中分离后再对其进行超高压处理，PHA血凝活性明显降低，在450 MPa时血凝活性基本丧失。所提取的PHA对单糖、二糖及糖醛酸和糖醇均无糖结合专一性。超高压处理对PHA的α-葡萄糖苷酶抑制活性影响较弱，在450 MPa处理后仍能维持一定活性，因α-葡萄糖苷酶抑制活性与PHA糖链结构密切相关，暗示超高压作用对PHA糖链作用较弱。第四，研究了PHA的α-淀粉酶抑制活性耐受消化道酶系的研究。在模拟胃部环境下，PHA的α-淀粉酶抑制活性仅为原活性的40%左右，而在模拟肠部消化过程中，活性无明显变化，表明PHA对α-淀粉酶的抑制活性对于胰蛋白酶的耐受程度较好。第五， 研究了PHA及其同分异构体对H9淋巴瘤细胞增殖抑制活性研究。利用SP-Sephadex阳离子交换柱层析对PHA的五种同分异构体进行分离，细胞试验证实PHA的L-型异构体对H9淋巴瘤细胞增殖增殖的抑制能力强于E-型。本项目成果：共发表论文17篇（SCI 12篇、EI 1篇）；申请发明专利2项；指导本科及硕士论文共2篇；参编《食品化学》著作一部。参加国际学术会议1次。