外膜蛋白LamB介导的细菌负调控耐药机制研究

It is well known that outer membrane proteins (OMPs) in Gram-negative bacterial play important roles on antibiotic resistance. In our previous study, outer membrane protein LamB was found to relate with antibiotics resistance,the lamB mutant strain would increase the resistance to antibiotics in Escherichia coli and the LamB-Odp1 complex mediated a negative regulation of antibiotic resistance mechanism. However, how LamB affects and how LamB-Odp1 complexes regulate this process are still largely unknown. In this study, to further investigate this antibiotic resistance mechanism and the complex protein-protein interaction network, combining metabonomics and proteomics techniques, we firstly compare the differential expression of proteins and the secretion of small molecule substances in Escherichia coli when treated with different type of antibiotics; Secondly, other proteins in LamB-Odp1 complexes would be identified by molecular biology technique such as co-immunoprecipitation and pull down method; Finally, the antibiotics resistance functions of these candidate proteins will be valued by antibiotics survival capabilities assay in related strains which gene was knocked out or over-expressed. In this way, we try to provide novel insights into mechanisms of antibiotics resistance of LamB-Odp1 and provide the theory evidence for pathogens control and prevention.

革兰氏阴性细菌的外膜蛋白在细菌耐药中起重要的作用。申请人以往研究发现外膜蛋白LamB在细菌多重耐药中起重要的负调作用，该基因缺失将导致细菌显著耐药，且LamB与Odp1可形成复合物并参与细菌耐药过程。但是，该蛋白影响细菌耐药过程的方式，以及该复合物参与细菌耐药的机制尚不明确。本课题在前期研究的基础上，首先，拟结合代谢组学和iTRAQ定量蛋白质组学技术研究lamB基因缺失后的大肠埃希氏菌在不同类型抗生素作用下的蛋白表达以及小分子代谢物分泌的变化，深入探讨LamB负调导致细菌耐药的内在蛋白变化及代谢网络调控机制；其次，利用免疫共沉淀、pull down等分子生物学技术寻找与鉴定LamB-Odp1复合物系统中的其他蛋白，并利用相应缺失或高表达菌株在不同浓度抗生素作用下的生存率，进一步评价该复合物系统在细菌耐药中的作用。研究结果将有助于深化对LamB及其复合物系统调控细菌耐药过程与机制的认识。

抗生素的广泛使用和滥用导致细菌病原体迅速产生耐药突变株，降低抗生素效价，给公共健康造成严重的威胁。在细菌耐药性产生过程中，外膜通透性的变化起着重要的作用。大肠杆菌中的外膜蛋白LamB，是麦芽糖和麦芽糊精的特异性通道，前期研究发现LamB蛋白可能是通过影响细胞内的代谢过程来调控细菌耐药性。而且近几年，多个研究表明代谢途径的调控对抗生素疗效有显著影响，但是从代谢水平研究LamB介导细菌耐药调控机制的研究目前尚不清楚。故本研究利用定量蛋白质组学和代谢组学相结合的策略对大肠杆菌BW25113和lamB基因敲除菌在环丙沙星（CFLX）的蛋白组学图谱和代谢组学图谱以及金霉素（CTC）作用下的蛋白组学图谱进行研究。对筛选出的差异蛋白和代谢物进行GO分析和KEGG代谢通路富集，分析结果显示，lamB基因缺失导致一系列关键代谢途径发生变化，例如TCA循环、氨基酸的生物合成、戊糖磷酸途径和糖酵解等代谢途径；在CFLX处理下，许多氨基酸-tRNA生物合成和嘧啶代谢相关蛋白和代谢物发生变化，而在CTC处理下，丙酮酸代谢途径相关的大部分蛋白表达下降，这表明ΔlamB菌株可能通过改变蛋白质翻译和能量代谢系统来获得抗生素耐药性。.以往研究中，有文献报导添加外源碳源分子，例如葡萄糖、果糖等代谢物，可以促进大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素以及爱德华氏菌对卡那霉素的摄取，从而提高抗生素疗效。在本研究中，蛋白质组学和代谢组学分析结果均发现，CFLX处理下ΔlamB菌株中许多氨基酸代谢途径发生下调表达。进一步研究发现，在大肠杆菌野生型和ΔlamB菌株中添加一些特定的外源氨基酸（丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸）以及麦芽糖与CFLX联用，均能提高CFLX的杀菌效果，而葡萄糖的效果不显著。研究结果表明细菌可能通过调控LamB蛋白表达来降低麦芽糖碳源的摄取，从而影响胞内代谢通路活动，增加细菌耐药性。因此，本研究有助于解释外膜蛋白LamB介导的负向耐药调控机制。.通过该项目的资助，共发表17篇SCI论文以及5篇中文核心期刊，基本完成课题目标。