致病性嗜水气单胞菌在生物膜状态下的耐药机制研究

Aeromonas hydrophila is a causative agent of many aquatic animals and also is a kind of typical human-domestic anima-fish's pathogens. Pathogenic A. hydrophila cause serious disease outbreaks in a variety of farmed fish, which lead to large economic losses in the aquaculture industry on an annual basis. The worldwide emergence of antibiotic resistant A. hydrophila poses a serious threat to aquaculture industry today due to too frequent and inappropriate use of antibiotics in farmed fish. A line of evidence has indicated that biofilm is involved in the antibiotic resistance while the mechanism is still unknown. In this study, using quantitative proteomic methodologies, different expression of secrete , cytoplasmic and membrane proteins from antibiotic-resistant pathogenic A.hydrophila strains were prepared and compared during biofilm-formed status. The altered proteins were screened as antibiotics resistance related proteins in biofilm format and then their functions were further valued by molecular biology methods such as over-express and knock out. In this way, we try to provide novel insights into mechanisms of antibiotics resistance of A. hydrophila in biofilm format and provide the theory evidence for screening novel vaccines.

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是多种水生动物的原发性致病菌,也是典型的人-兽-鱼共患病病原菌，每年由该菌导致的鱼类暴发性流行病给水产养殖业造成了严重的经济损失。由于养殖业中抗生素的普遍使用，该菌的耐药问题已经十分严重。目前已知细菌的生物膜对细菌产生耐药性至关重要，但是对生物膜导致细菌耐药的机理还有待进一步的深入研究。因此本项目拟采用标记定量蛋白质组学技术，比较耐不同类型抗生素的致病性嗜水气单胞菌在生物膜状态下其分泌蛋白、胞浆蛋白和膜蛋白表达的差异，由此筛选出生物膜抗生素相关蛋白，并通过表达、缺失相关基因等分子生物学方法研究这些相关蛋白的功能，试图阐明致病性嗜水气单胞菌生物膜形成导致细菌耐药的机制，为新型疫苗的筛选提供了理论依据。

本课题以能引起强耐药性的生物膜状态下的嗜水气单胞菌为研究对象，利用标记定量蛋白质组学技术，比较耐不同类型抗生素的致病性嗜水气单胞菌在生物膜状态下其可溶性蛋白和膜蛋白表达的差异，由此筛选出生物膜抗生素相关蛋白和途径，并通过分子生物学方法研究这些相关蛋白的功能，试图阐明致病性嗜水气单胞菌生物膜形成导致细菌耐药的机制，为新型疫苗的筛选提供了理论依据。.首先，课题通过TMT标记定量蛋白质组学技术，比较生物膜状态下耐金霉素嗜水气单胞菌与对照菌株在一定抗生素浓度作用下蛋白的表达差异，结果发现细菌在应对抗生素胁迫的适应性耐药，以及发生遗传突变的遗传性耐药机制之间，具有中度的相关性，提示两者具有密切的进化联系。进一步的qPCR、western blotting以及代谢途径抑制试验证明，FabD等与细菌脂肪酸合成途径相关蛋白在细菌生物膜的耐药过程中，起重要的作用。当抑制脂肪酸合成途径后，细菌显著对抗生素敏感，提示FabD等蛋白可以作为新型疫苗的靶点，同时提出脂肪酸合成抑制剂与四环素类抗生素联用，可以有效抑制细菌的新策略。.其次，研究发现多种细菌膜蛋白参与细菌的适应与遗传耐药机制，涉及跨膜转运、生物合成过程等多种途径，其中，A0KHH2、A0KJ25、A0KPY3等内膜或者外膜蛋白是首次发现的与细菌耐药相关蛋白，值得进一步研究探索。.课题还结合iTRAQ标记和SWATH技术，对嗜水气单胞菌在土霉素胁迫下的耐药机制进行系统的定量蛋白质组学研究。通过sMRMHR、qPCR技术以及酶活测定等方法验证，在土霉素胁迫下许多参与蛋白质合成和翻译的相关蛋白表达量有所增加，而参与能量生成代谢途径等相关的蛋白表达量却相对减少。研究表明，该病原菌可能是通过下调参与新陈代谢途径的蛋白表达以及上调参与其翻译相关的蛋白，来应对环境中的抗生素胁迫并产生细菌耐药性。这与当前细菌耐药研究新进展高度吻合，提示逆转这些关键途径，可以为有效抑制耐药细菌提供新的策略。.最后，课题比较了耐磺胺对甲氧嘧啶的耐药蛋白质组学，结果发现多个生物膜蛋白参与细菌的适应与遗传耐药机制，涉及翻译、能量产生与氨基酸代谢等多个代谢途径，值得进一步研究探索。.通过以上研究，使我们对嗜水气单胞菌及其生物膜状态下的耐药机制有了更深刻的认识，为进一步研制新型抗生素或者疫苗提供理论基础。