儿童哮喘易感基因ORMDL3的多个启动子及剪接异构体的鉴定

Orosomucoid 1-like 3 (ORMDL3) gene dysregulated expression is a risk fact for child asthma, but the expression regulation mechanism is still unclear. Promoter and alternative splicing play important roles in regulating gene expression. Bioinformatics analysis and our preliminary study indicated that ORMDL3 has multiple promoters and alternative splicing variants. We hypothesis that ORMDL3 expression is regulated by multi-promoters and alternative splicing. We use 5'RACE, 3'RACE and primer extension analysis to define the alternative spliced variants; Luciferase activity assay, Patch methylation assay, Methylation-Specific PCR, point mutation and deletion mutation to define the core promoter type and key transcription factor binding sites; Chromatin immunoprecipitation assay, Electrophoresis mobilityshift and supershift assay, RNAi and over-expression to confirm the role of transcription factors on promoter activities and alternative splicing; Real-time PCR and Methylation-Specific PCR test the splicing variants expression differences and methylation differences between asthma children and the health. This research will find the important information of ORMDL3 transcriptional regulation, and the finding will be used to clinical molecular diagnosis and gene therapy of genome variation induced children asthma.

ORMDL3基因表达异常是儿童哮喘发病的危险因素，但该基因表达调控机制尚不明了。启动子和可变剪接在调控基因表达中起重要作用。生物信息学分析及我们前期研究发现，该基因有多个转录起始位点，表明该基因存在多个启动子及剪接异构体。我们假设ORMDL3表达受多个启动子和可变剪接调控。我们拟用快速末端扩增和引物延伸法寻找不同启动子的位置及多个剪接异构体；荧光素酶活性分析、补丁甲基化、甲基化特异性PCR、点突变和缺失突变，确定核心启动子的类型及关键转录因子结合位点；染色质免疫共沉淀、凝胶迁移实验、RNAi和过度表达有关转录因子证实对启动子的调节作用、对剪接异构体的影响；最后用荧光定量PCR和甲基化特异性PCR检测哮喘患者和健康对照组ORMDL3剪接异构体表达和启动子甲基化差异。这些研究将提供ORMDL3转录调控的关键信息，研究结果有望用于儿童哮喘基因组变异的临床分子诊断和新分子靶点的基因治疗。

ORMDL3基因表达异常是儿童哮喘发病的危险因素，但该基因表达调控机制尚不明了。启动子、可变剪接、甲基化在调控基因表达中起重要作用。本研究发现：1.用5‘RACE发现ORMDL3有多个转录起始位点，转录不同剪接异构体；2. ORMDL3 mRNA、蛋白、启动子甲基化水平在哮喘儿童和健康对照儿童外周血单核细胞中存在显著差异；3.该基因启动子区域含有CpG岛，体外研究发现，甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR调节该基因启动子区甲基化水平，影响该基因mRNA和蛋白表达；4.ORMDL3基因启动子甲基化水平与哮喘患儿血清IL-6/IL-8分泌和外周血单核细胞内p-ERK/MMP-9水平呈负相关，体外研究发现5-Aza-CdR通过调控ORMDL3转录影响IL-6/IL-8分泌和MMP-9和p-ERK表达；5.重组过敏原（rPla a2, rJun v1）抑制ORMDL3甲基化增加ORMDL3表达。本研究的科学意义：1.本项目对哮喘易感基因ORMDL3的转录调控机制展开研究，发现该基因存在多个转录起始位点，存在多种转录本；对其启动子研究发现该基因启动子受甲基化调控，从表观遗传学层面揭开该基因转录调控机制的面纱；2.本研究发现，ORMDL3基因表达受甲基化调控，该基因启动子甲基化水平在哮喘患儿和健康儿童中表达存在差异；且体外研究发现，该基因甲基化水平影响该基因蛋白表达量的同时，影响哮喘相关信号分子IL-6、IL-8、p-ERK、MMP-9的表达。这些研究发现，为理解该基因参与哮喘发病机制提供线索、为哮喘治疗药物研究提供靶点；3.本研究发现重组过敏原（rPla a2, rJun v1）对ORMDL3基因的表达存在影响。重组过敏原和甲基化调控对该基因表达的调控，有助于揭示环境和遗传如何相互作用影响哮喘的发病、增加特殊人群的哮喘易感性。