PARP-1/AIF信号通路在重离子诱导神经细胞凋亡中的调控作用研究

Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1),one of the most abundant nuclear, is highly conserved in eukaryotes.The gene mutation, deletion and overexpression of PARP-1 will directly impact the process of apoptosis. Apoptosis-inducing factor (AIF) is stimulated from excessive PARP activation to trigger non-Roles of caspases (caspase)-dependent apoptosis,which induces AIF translocation from the mitochondria to the nucleus. It has been proved that PARP-1/AIF pathway play a decisive role in ischemia-reperfusion-induced neuronal apoptosis. However,it remains unclear how to regulate heavy ion-caused apoptosis via interacting between PARP-1 and AIF. The project bulid the modle including mutant cell mediated by a lentiviral system for RNA interference and overexpression of target gene to identify the relationship between PARP-1 and AIF determined by Laser-scanning confocal microscopy (LSCM) or co-immunoprecipitation analysis after heavy-ion irradiation. .We confirm whether PARP-1/AIF pathway is the important way to induce neuronal apoptosis in heavy-ion radiated cells through blocking Caspase-dependent pathway combined with Western blot method. Our study aim to investigate to explore a new mechanism of heavy ion-induced neuronal apoptosis in light of PARP-1/AIF-mediated caspase-independent apoptosis pathway.

PARP-1是真核细胞中高度保守的核蛋白酶，PARP-1基因的突变、缺失及过表达都将直接影响到细胞凋亡进程。凋亡诱导因子（AIF）受过度活化PARP-1刺激，从线粒体转位至细胞核内触发非Caspases（胱天蛋白酶）依赖的细胞凋亡。业已证实，PARP-1/AIF通路在缺血再灌注引起的神经细胞凋亡中发挥决定性作用，但在重离子诱导的神经细胞凋亡中，PARP-1/AIF通路的作用地位以及两因子间的相互调控关系仍不明确。本项目拟采用重离子致神经细胞凋亡模型，利用激光扫描共聚焦显微镜技术、免疫共沉淀及慢病毒载体基因敲除或过表达,明确PARP-1与AIF的相互作用关系；并利用Caspases通路阻断结合免疫印迹法，证实PARP-1/AIF通路是重离子诱导神经细胞凋亡的重要途径之一。本项目以非Caspases的PARP-1/AIF凋亡通路为切入点，旨在探索重离子诱导神经细胞凋亡的新机制。

本项目在基金委的资助下，基本阐明了PARP-1/AIF信号在重离子诱导的神经细胞及神经胶质瘤细胞中的促凋亡效应。Hocehest染色和AnnexinV-PI双染流式细胞仪检测结果显示，在施用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK后，碳离子辐射引起的细胞凋亡百分数并未有显著地下降，其中AnnexinV单染细胞的比例较单独照射组略有增高，说明碳离子辐射有效地开启了非-caspase依赖的信号通路，尤其在细胞的早期凋亡阶段。AIF作为介导非-caspase细胞凋亡途径的重要因子，是否在重离子诱导的凋亡中发挥关键的作用？我们构建了AIFM/GV230真核过表达质粒,在辐照前48h过表达质粒转染细胞，在碳离子辐射24h后检测了转染48h后AIF蛋白的表达水平，结果显示与未转染的野生型细胞及空质粒转染细胞相比，凋亡率随着AIF蛋白的表达量增加而显著增高（P<0.001）。利用Flowsight多维全景流式细胞仪检测发现，碳离子辐射促进了AIF从线粒体释放并进入胶质瘤细胞核，在核内呈现高转位水平，在caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理组转位频率达到52.6%，说明caspase活性的抑制增加了辐射引起的AIF的核转位。辐射是否会产生大量DNA损伤从而激发PARP-1的表达？我们应用彗星电泳和8-OHdG的检测方法发现碳离子诱导了大量的DNA损伤。同时，采用real-time PCR及Western blot手段检测PARP-1mRNA和蛋白在胶质瘤细胞内的表达情况，结果显示碳离子辐射显著地上调了PARP-1的表达。用抑制剂3-AB阻断PARP-1的活性，发现丢失PARP-1活性显著地降低了碳离子诱发的细胞凋亡比例。Western blot结果显示PARP-1和AIF辐照后表达趋势一致，说明两者之间存在密切关系。进一步分析PARP-1/AIF在细胞中的共定位分布，激光共聚焦结果亦表明，在辐射后的细胞核中出现较强的双荧光表达信号，证实了碳离子辐射下的PARP-1和AIF蛋白相互作用。通过相关性分析发现PARP-1表达水平和AIF核转位频率间存在明显的相关性（y=19.18x-5.826, R2 =0.951）。这些数据说明，PARP-1在AIF介导的碳离子促细胞凋亡中起到决定性的作用。综合以上结果表明PARP-1/AIF通路是重离子诱导的神经及神经胶质瘤细胞凋亡的重要通路之一。