嗜热厌氧菌降解生物质废弃物耦合生物制氢和燃料乙醇协同机制研究

Synergistic mechanisms in the biodegradation of lignocellulosic waste for the production of fuel ethanol coupled with biohydrogen via coculture of cellulose-utilizing strain Clostridium thermocellum and xylan-utilizing strain Thermoanaerobacterium aotearoense will be investigated with cassava pulp and sugarcane bagasse as substrates by metabolic design and flux control. Lactic acid pathway of Clostridium thermocellum and Thermoanaerobacterium aotearoense will be deleted by gene knockout technique to increase ethanol and hydrogen fluxes. Real time quantitative RT-PCR will be used for tracking microbial communities in the co-culture system. The present proposal may design strains with increased hydrogen and ethanol flux, reveal the synergistic mechanisms of fuel ethanol and biohydrogen co-production between T.aotearoense and C.thermocellum with lignocellulosic waste cassava pulp and sugarcane bagasse as substrates, and uncover the communities profile in the co-culture system, which is of significant importance in exploring the industrial utilization of lignocellulosic waste.

利用微生物种群设计和控制技术，以筛选的能够直接利用半纤维素的嗜热厌氧杆菌T.aotearoense和能够直接利用纤维素的嗜热厌氧梭菌C.thermocellum为菌种，以低品位生物质废弃物木薯渣和甘蔗渣为原料，对嗜热厌氧菌降解生物质废弃物耦合产氢和燃料乙醇的协同机制进行研究；在对嗜热厌氧菌C.thermocellum和T.aotearoense 代谢流分析的基础上，采用基因敲除技术沉默乳酸代谢途径，提高氢和乙醇代谢流；利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术对设计菌株在产氢和燃料乙醇体系中的种群变化进行追踪；利用代谢控制技术提高氢和乙醇得率。本项目不仅有可能设计氢和乙醇代谢流增加的菌株，揭示设计种群降解生物质废弃物耦合产氢和燃料乙醇的协同机理和种群的变化规律，而且在探索生物质废弃物利用方面具有重要意义。

本项目采用乙醇耐受性驯化和基因敲除技术，对嗜热厌氧杆菌乙醇耐受性进行驯化，对T.aotearoense乳酸代谢支路的乳酸脱氢酶进行沉默，并对生长动力学及代谢途径进行对比和分析；采用RT-PCR技术对共发酵菌种的生长动力学进行研究，并对其协同降解机理进行了探索，提出了可能的CBP共培养资源化途径。.对甘蔗渣主要成分进行了分析，对NaOH、离子液体和Fenton反应与NaOH耦合预处理甘蔗渣进行了研究，对预处理效果采用酶解和SSCF进行了评价。结果表明，Fenton反应与NaOH联合预处理甘蔗渣最优条件下同步糖化共发酵效率达到108.3%。经过Fenton反应与NaOH联合预处理后的甘蔗渣表面结构被打乱，木质素去除率达到59.8%，结晶度增大。 .对嗜热厌氧菌直接降解生物质特性进行了研究，表面活性剂对C. thermocellum介导的甘蔗渣生物糖化有显著促进作用，对产氢影响不大，对表面活性剂促进生物催化机制进行了研究。CaCO3对嗜热厌氧梭菌降解甘蔗渣产氢影响显著，最优的CaCO3添加量为20mM，氢气产量提高了116.72%。CaCO3的添加可明显提高生物量，碳酸盐的pH缓冲作用可促进甘蔗渣产氢。.对C.thermocellum乙醇耐受性的驯化及嗜热厌氧菌乳酸脱氢酶的沉默进行了研究。采用外源酒精胁迫的方法将C.thermocellum野生菌的酒精耐受性提高到5.0%。对嗜热厌氧菌乳酸脱氢酶基因进行沉默，得到乳酸脱氢酶缺失的菌株T. aotearoense Δldh，其生长不受影响，产氢效率显著提高。.建立了利用实时荧光定量PCR检测C.thermocellum和T.aotearoense在木质纤维素中生长的方法，并将该方法用于共培养体系菌群结构变化研究。结果发现：共培养产氢有明显优势，相对于单培养提高了43.5%，两种菌的生长呈现较好的同步性。CaCO3可以强化嗜热厌氧菌共培养降解甘蔗渣，氢气和乙酸的积累大幅度提高，增加了体系的稳定性。低浓度的Ca2+可以增强共培养体系菌体的生长和代谢能力，而高浓度Ca2+反而抑制了菌体的生长和代谢，降低了氢和乙酸产量；CO32-有利于共培养菌体的生长和代谢，对氢气和乙酸产量有显著地促进作用。.项目研究不仅在废弃生物质的资源化处理方面提供新的思路而且在生物产氢方面具有重要意义，促进了相关学科的发展。.