弥漫性大B细胞淋巴瘤中microRNA调控PRDM1基因甲基化表达的机制研究

MicroRNAs是一类长约21~23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，目前的研究已证实它与肿瘤的发生发展密切相关，并受DNA甲基化等表观遗传机制调控。转录因子阳性调控区锌指蛋白Ⅰ（PRDM1）基因是B淋巴细胞终末分化过程中的主调控子，在许多淋巴瘤亚型中均发现该基因的异常表达。前期研究中，我们发现PRDM1β异构型与DLBCL患者不良预后密切相关，在PRDM1β异构型基因的启动子区域存在低甲基化现象，DNA去甲基化药物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以逆转PRDM1α/PRDM1β表达，诱导淋巴瘤细胞发生凋亡。本课题拟阐明DLBCL中特异表达的microRNAs调控PRDM1基因甲基化表达的机制，进一步验证PRDM1参与DLBCL病理过程的分子机制。一方面为DLBCL疾病进展的分子标志物研究提供更多的依据，另一方面为开展淋巴瘤分子靶向治疗寻找新的靶点。

阳性调控结构域1（PRDM1）蛋白在B细胞分化过程中发挥重要的作用，它属于转录抑制调控子，并具有两个亚型结构，分别称作PRDM1α和PRDM1β。前者属于抑癌基因，并在弥漫大B细胞淋巴瘤某些亚型中通常处于失活状态，而后者为功能缺陷型，并在某些DLBCL亚型中表现为过表达。为了研究表观遗传机制是否参与调控这两个亚型基因的表达，我们首先通过重亚硫酸盐测序的方法检测了B淋巴瘤细胞株中这两个基因启动子CpG岛区域的甲基化水平，并应用MassARRAY定量DNA甲基化技术来分析DLBCL患者的肿瘤组织样本。结果显示PRDM1β基因的启动子CpG岛区域较正常细胞或非肿瘤组织总是呈现出低甲基化/去甲基化状态。而对于PRDM1α基因的启动子CpG岛区域，甲基化的状态则呈现出复杂的状况：高甲基化和低甲基化同时并存于DLBCL肿瘤组织中，而非肿瘤组织则呈现为中等程度的甲基化水平。进一步对CpG岛的位点进行分析，发现其中有两个位点：CpG 7和CpG 16-21，在DLBCL中表现为明显的高甲基化，而且CpG 16-21的甲基化水平的高低与DLBCL中表达PRDM1α和PRDM1β有一定的相关性。为了明确DLBCl中特异表达的microRNA是否参与调控PRDM1α和PRDM1β基因的表达，我们应用DNA甲基化抑制剂5-aza处理Namalwa细胞株，结果得到27个上调和31个下调差异表达的miRNA，其中上调的3个miRNA: miR-4754, miR-361-5p, and miR-320c和1个下调的miR-92b-3p表达水平在DLBCL肿瘤组织与反应性增生组织中具有显著性差异。我们的结果表明PRDM1α基因的异常甲基化以及PRDM1β基因的低甲基化状态是DLBCL中一个普遍的事件，DNA甲基化亦可以调控microRNA的表达。这种异常甲基化的模式可能导致DLBCL中PRDM1α/PRDM1β基因的失衡，表观调控的失调可能与肿瘤的发生相关。