哈氏蜈蚣谷氨酰转移酶Ssd-GGT诱导血小板聚集的作用机制

Gamma-glutamyl transpeptidase (GGT) catalyzes the transfer of the gamma-glutamyl moiety of glutathione to an acceptor that may be an amino acid, a peptide or water (forming glutamate). GGT plays a key role in the synthesis and degradation of glutathione and drug detoxification. GGT activity can be found in diseases of the liver, biliary system, and pancreas. It has been used as a biomarker of liver function test available for several decades, initially used as a sensitive indicator of alcohol ingestion, hepatic inflammation, fatty liver disease, and hepatitis.Centipedes have been used as Chinese traditional medicines with great clinical importance for more than two thousand years. They have venom glands in their first pair of limbs which is the most important organ for predation and defense. However, information about the compositions and functions of their venoms is largely unknown. Recently, we investigated the venoms of Scolopendra subspinipes dehaani by transcriptomic and proteomic analysis coupled with biological function assays. We were interested in one component named Ssd-GGT which showed significant siminarity to human GGT with 67% sequence identity. Ssd-GGT is composed of two heterogenous subunits named α and β.Interestingly, Ssd-GGT can induce human platelet aggregation dose-dependently. However, no relation between GGT and platelet aggregation has been reported to our knowledge. This result provides a new view angle of function of GGT.This study will investigate the mechanism of platelet aggregation induced by Ssd-GGT by molecular methods such as expression and mutation and identifing the receptor on the platelet membrance. The result can not only reveal the molecular mechanism of wound-healing effect of Ssd-GGT which is considered as a prospective drug but also help us understand the function of GGT and give some new prospective and direction with great biological and medical importance of fundamental and clinical value.

γ-谷氨酞转移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）是一类酰基转移酶，在人肝、肾等多种器官都有表达，主要参与谷胱甘肽合成和降解，在药物解毒和胞内氧自由基平衡方面发挥重要作用。作为一种分子marker，GGT被用于肝脏疾病临床诊断已经有数十年历史。前期工作中，我们以哈氏蜈蚣为研究对象，从其毒液中分离得到一个序列比对结果为谷氨酰转移酶的蛋白质（命名为Ssd-GGT），该蛋白质具有诱导血小板聚集的活性，为研究GGT的功能提供了一个崭新的视角。因此，本研究项目旨在用分子生物学表达和突变，以及细胞膜受体鉴定等手段揭示哈氏蜈蚣Ssd-GGT诱导人血小板聚集的机制。研究成果不仅可以揭示Ssd-GGT作为潜在伤口辅助愈合药物的分子机制，而且可望在人GGT的功能研究以及在临床上作为分子marker的应用方面提供新的思路及方向，具有重要的生物医学基础研究和临床应用价值。

蜈蚣是一味传统动物中药材，常用于治疗惊厥抽搐、疮疡、蛇虫咬伤等。虽然蜈蚣在临床上应用已经有上千年历史，但是对蜈蚣毒素的研究却很少。在前期工作中，我们首次从转录组学、蛋白质组学和生物学功能三个层面对哈氏蜈蚣毒素进行了系统研究，对蜈蚣的药效分子群和药理学活性进行了迄今为止最全面系统的揭秘,新识别了400余种蜈蚣肽类生物活性物质。我们对其中一个能诱导血小板聚集的组分感兴趣，该组分由α和β两个亚基组成，与人源谷氨酰转移酶有较高的序列相似性，命名为Ssd-GGT。这是首次发现谷氨酰转移酶类似物有诱导血小板聚集活性的报道。于是申请了本课题，拟对Ssd-GGT诱导血小板聚集的作用机理进行研究。我们首先对Ssd-GGT进行了原核表达，结果显示分别表达α和β两个亚基单独均无血小板聚集诱导活性，两个亚基同时表达的时候有活性，但是活性仅有天然Ssd-GGT的18%。推测两个亚基需要相互结合才能引起血小板聚集。我们对α亚基进行了定点突变，用甘氨酸替代112号位点的谷氨酸，结果表明：该氨基酸替换之后的重组 Ssd-GGT不能诱导血小板聚集，表明该氨基酸残基对Ssd-GGT诱导血小板聚集有重要作用。在受体筛选方面，分别选用P2类受体抑制剂PPADS和PAR受体抑制剂Palmitoylethanolamide进行了受体阻断实验。结果表明： Palmitoylethanolamide对血小板聚集没有影响，但是PPADS能抑制Ssd-GGT对血小板聚集的诱导作用，提示P2类受体参与了Ssd-GGT诱导血小板聚集的过程。亲和层析实验表明actin可能参与了Ssd-GGT诱导血小板聚集。在Ssd-GGT与Glycine对照组差异蛋白中，Coronin在Ssd-GGT中的含量是Glycine组的6.95倍，提示在Ssd-GGT诱导血小板聚集过程中，Coronin可能通过actin发挥作用。本实验结果初步证实了P2类受体参与了Ssd-GGT有到血小板聚集的过程，Coronin和actin也与Ssd-GGT诱导血小板聚集相关，这在血小板聚集激活过程中是十分少见的，有可能是新的信号通路，有较大的研究价值。