TRP-ERK通路在低温解除中国卤虫休眠胚胎滞育过程中的作用及分子机制

Diapause termination of dormant embryo from Artemia sinica may be induced by Low temperature and freeze, but the morlecular mechanism of diapause terminated still remains unknown. In our previous researches, we found there was obvious up-regulation of expression level of trp,erk and gk genes when low temperature induced diapause terminated of dormant embryo from A. sinica, which suggested these genes play important roles in diapause termination of dormant embryo. In the project, based on the previous work described above, rapid-amplification of cDNA ends (RACE)technique will be used to obtain the full-length cDNA of each gene; Real-time PCR methord will be used to analyze the expression pattern of these genes in diapause termination of dormant embryo.The expression location in A. sinica embryo of these genes and corresponding proteins will be investigated by in situ hybridization and immunohistochemistry assay. The relationship among these genes,ERK pathway, glycol-sorbitol metabolic enzyme and cell cycle pathway will be confirmed using Western-Blot analysis. The functions of these genes will be analyzed by siRNA gene-silencing assay. The molecular mechanism of diapause termination will be demonstrated further through above experiments. All these researches have important significance of explaining the molecular mechanism of diapause terminated in Artemia and other crustaceans and in utilization of Artemia resource.

低温冷冻可以诱导中国卤虫休眠胚胎解除滞育，但终止滞育的分子机制目前还没有搞清楚。我们的前期工作发现trp、erk和gk等基因在低温诱导卤虫胚胎解除滞育过程中出现明显上调，提示其在低温诱导卤虫胚胎终止滞育中起到重要作用。本课题在我们前期得到的终止滞育相关基因trp、erk、gk、sk和sd研究的基础上，拟采用RACE技术获得各基因的全长；以Real-Time PCR法分析各基因在低温解除卤虫胚胎滞育各时期的表达模式；以原位杂交和免疫组化法分析各基因及蛋白在卤虫胚胎的表达部位；采用Western-Blot等方法确定上述各基因的相互关系及与ERK通路、糖原-山梨醇代谢、细胞周期相关通路的关系，以siRNA法研究各基因的功能，从而进一步确定由trp-erk通路调控的卤虫终止滞育的分子机制。上述研究为完善甲壳动物终止滞育的分子机制理论具有重要的理论意义，在卤虫资源的开发利用方面具有一定的应用价值。

中国卤虫（Artemia sinica）滞育胚胎经过低温处理后，胚胎会解除滞育重新发育。本项目旨在采用RACE、Real-time qPCR、RNA原位杂交、Western blot和siRNA等方法，分析trp-erk调控途径在滞育解除过程中的作用，以进一步揭示卤虫滞育解除的分子机制。.本研究首次发现：（1）TRP蛋白受到外界低温信号刺激后激活，使非选择性离子通道开放，Ca+离子内流激活ERK通路，ERK通路调控GK、SD、SK、GSK、Kip2、Cyclin B、AKT、AMPK的表达，完成能量代谢和细胞周期过程；（2）滞育解除后TRPc4蛋白明显高表达，作为细胞周期蛋白激酶抑制因子的As-Kip2基因呈现低的表达水平，随着生长发育的进行，细胞分裂生长的速度加快，As-Kip2的表达量随之上调，并调控细胞周期滞育通路相关蛋白的作用，在胚胎发育开始启动过程中发挥重要作用；（3）中国卤虫在滞育时胚胎内储备甘油、山梨醇和不饱和脂肪酸，以抵御低温等不良环境的损害。在解除滞育后，甘油激酶（GK）和三梨醇脱氢酶（SDH）和山梨醇激酶（SK）的表达上调，使这些物质转化为糖类供给胚胎能量。GSK在胚胎发育各时期差异并不显著，值得注意的是, As-GSK3β-Ser9p表达水平先高后低,在然后急剧下降。表明，GSK磷酸化后，即GSK3β-Ser9可以参与糖原代谢。随着胚胎的发育相关基因通过一系列的调控作用，分解掉滞育后留在胚胎中的山梨醇和甘油，以提供胚胎继续发育的能量；（4）在冷刺激的作用下，TRP可以激活APC复合体，使休眠中处于G0期的细胞进入G1期，并在泛素化的作用下调控细胞内的细胞周期活动，揭示APC/C复合物是控制有丝分裂和G1期进程的主要物质。.本项研究为完善卤虫和其他甲壳动物滞育解除的分子机制具有重要的理论意义，在卤虫资源的开发利用方面具有一定的应用价值。