Annexin3介导anxa3/lea/drrb/atf3途径激活中国卤虫滞育胚胎重启动的分子机制

After diapause termination of embryo from Artemia sinica, embryonic cells are still in the stationary state, the effect of suitable environmental conditions and regulation of related genes can actived diapause embryo development restarting. but the molecular mechanism of diapause embryonic restarting is still unknown. In our previous researches, we found there was obvious change in expression levels of anxa3, trpm8, lea, drrb and atf3 genes in process of diapause embryo from A. sinica restarting, which suggested these genes play important roles in diapause embryo restarting. In the project, based on the previous work described above, rapid-amplification of cDNA ends (RACE)technique will be used to obtain the full-length cDNA of each gene; Real-time qPCR methord will be used to analyze the expression pattern of these genes in diapause embryo restarting.The expression location in A. sinica embryo of these genes and corresponding proteins will be investigated by in situ hybridization and immunohistochemistry assay. The relationship among these genes,cell cycle, cell apoptosis pathway will be confirmed using Western-Blot analysis. The functions of these genes will be analyzed by siRNA gene-silencing assay. The molecular mechanism of diapause embryo restarting will be demonstrated further through above experiments. All these researches have important significance of explaining the molecular mechanism of diapause embryo restarting in Artemia and other crustaceans and in utilization of Artemia resource.

中国卤虫滞育解除后，胚胎细胞仍处于静止状态，在外界条件作用和相关基因的调控下，滞育胚胎能够重新启动发育，但胚胎重启动的分子机制目前还没有搞清楚。我们前期工作发现anxa3、trpm8、lea、drrb和atf3调控轴在胚胎重启动过程中有明显的表达水平的变化，提示其在胚胎重启动过程中发挥重要作用。本课题在我们前期工作的基础上，拟采用RACE技术获得各基因的全长；以Real-Time qPCR法分析各基因在胚胎重启动过程中的表达模式；以原位杂交和免疫组化法分析各基因及蛋白在卤虫胚胎的表达部位；采用Western-Blot等方法确定上述各基因及与细胞周期、细胞凋亡等相关通路的关系，以siRNA法研究各基因的功能，从而进一步确定由该调控轴在卤虫滞育胚胎重启动过程中的作用及分子机制。上述研究为完善甲壳动物滞育胚胎重启的分子机制方面具有重要的理论意义，在卤虫资源的开发利用方面具有一定的应用价值。

中国卤虫（Artemia sinica）胚胎终止滞育后，细胞仍然处于静止期，需要一定的外部环境条件和内部的分子调控过程发育才会重新启动。本研究采用基因克隆技术、qPCR、RNA原位杂交、Western blot和siRNA等技术，分析了anxa3介导的trp/anxa3/lea/drrb/atf3 调控轴激活中国卤虫滞育胚胎重启动过程中的作用，以进一步揭示卤虫滞育胚胎重启动的分子机制。.研究发现:（1）中国卤虫滞育胚胎滞育终止后，TRPM8的表达量呈现先高后低趋势，但ANAX3的表达量明显升高并参与调控KIP2、ATF3、CDK-1、CDK-2、CDK4及CDK6、Cyclin B、Cyclin E、CDKs等细胞周期相关蛋白表达，通过激活细胞周期蛋白的表达，胚胎打破细胞周期阻滞，开始重新发育；（2）As-RAD9参与细胞周期检查点蛋白的调控和滞育胚胎DNA的快速复制并与维持滞育胚胎细胞基因组的稳定性有关。RAD9参与G1细胞周期阻滞的解除和G2/M调控、环境应激或基因损伤引起的DNA复制、检查点信号通路的调控，使滞育胚胎开始重启动；（3）DNA damage-regulated protein 1与P53、 MDM2和 P21等基因共同参与细胞凋亡、基因表达、DNA修复、细胞周期调控等细胞过程，以淘汰翻译错误及不正常的胚胎细胞、保护胚胎细胞进入重启动过程；（4）胚胎处于静止状态时，TRPM8作为冷信号感受器接受了低温信号而处于激活状态，并激活下游的Annexin3基因，在anxa3介导下调控DRRB及ATF3蛋白的表达，抑制LEA的大量表达。该调控轴参与细胞周期调控过程，使滞育胚胎细胞打破静止期而进入细胞周期，胚胎细胞重新开始分裂，发育重新启动开始。.本项研究为完善卤虫和其他甲壳动物滞育胚胎重启动的分子机制具有重要的理论意义，在卤虫资源的开发利用方面具有一定的应用价值。