NLRP3介导的c-di-AMP促进抗Mtb免疫保护作用及机制

Mycobacterium tuberculosis parasitizes in host macrophages for long time, which is the main barrier of prevention and treatment against TB. The NLRP3 inflammasome plays an important role in anti-infection immune. however M. tuberculosis inhibits NLRP3 by unknown mechanism. c-di-AMP is a new signal molecule in bacterium which has been proved that can induce innate and adaptive immune response, and active NLRP3, as well as regulate bacterium physiological processes. Our previous works had showed that increasing c-di-AMP level in M. tuberculosis induced host innate immune response and more cell death. The expression of caspase-1, one sigh of inflammasome activation, is also increased. Moreover, the bacterium loads were decreased in infected mice organs. Our hypothesis is that c-di-AMP adjusts the expression of M. tuberculosis proteins interactive to NLRP3, and actives NLRP3, which leads the immune clearance of M. tuberculosis. This study will use synthetic and nature c-di-AMP secreted from mycobacterium to transfect macrophages to investigate activation of NLRP3 by c-di-AMP. This study will reveal the molecular mechanism through detecting the regulation of c-di-AMP on M. tuberculosis interacting proteins with NLRP3 and screening macrophage interacting proteins with c-di-AMP. On this bases, the study will detect the effect and efficiency of immune clearance against M. tuberculosis through c-di-AMP by NLRP3 activation. Thus this study will be helpful for c-di-AMP to be used in new drug and vaccine research against M. tuberculosis.

Mtb在Mφ中长期存活是TB防治难题。NLRP3是机体抗感染免疫重要一环，而Mtb可抑制NLRP3活化，但机制不清。细菌的新信号分子c-di-AMP（cdiAMP）不仅调控细菌基因表达，促进固有和适应性免疫应答，还可激活MφNLRP3。本室研究表明，cdiAMP水平升高的菌株感染Mφ，可促进固有免疫应答，引起细胞死亡，且caspase-1表达增加，感染小鼠体内荷菌数降低。推测：cdiAMP可调节Mtb中作用于 NLRP3分子的表达，并可激活NLRP3，最终促进感染Mtb的免疫清除。本研究拟采用合成和天然的cdiAMP作用于Mφ，明确其对 NLRP3的激活作用；检测cdiAMP对Mtb中作用于NLRP3分子的调节，筛选Mφ中与cdiAMP作用的分子；在此基础上，明确NLRP3介导的cdiAMP促进Mφ和感染动物免疫清除Mtb的作用。本研究将为cdiAMP用于细菌感染的新药物和疫苗研究提供依据

Mtb在Mφ中长期存活是TB防治难题。NLRP3是机体抗感染免疫重要一环，而Mtb可抑制NLRP3活化，但机制不清。c-di-AMP不仅调控细菌基因表达，促进固有和适应性免疫应答，还可激活Mφ NLRP3。本研究分别采用c-di-AMP、过表达c-di-AMP合成酶的重组卡介苗（rBCG）、敲除c-di-AMP分解酶和合成酶过表达的的重组耻垢分枝杆菌（rMs）作用于Mφ，明确了c-di-AMP对 NLRP3具有激活作用，而上述菌株免疫小鼠后并不引起IL-1β分泌增加，表明c-di-AMP诱导的NLRP3激活具有一定时效性；蛋白质组学研究表明，c-di-AMP在细菌内水平变化可调节休眠、代谢、NLRP3以及自噬相关基因的表达；通过检测rMs中NLRP3作用分子的表达，明确c-di-AMP可通过调节Mtb NLRP3激活和抑制分子的表达，进而调控宿主NLRP3活性；Mtb NLRP3激活因子ESAT-6抑制自噬，而c-di-AMP为自噬的诱导剂，c-di-AMP水平升高的rMs下调ESAT-6表达，其诱导自噬能力显著增强；体外筛选Mφ中与c-di-AMP直接作用的分子，但未能获得相互作用蛋白，随后发现Mφ中DHH结构域蛋白Prune可能对c-di-AMP具有直接作用，对其活性研究仍在进行中；制备NLRP3激活分子ESAT-6的单克隆抗体，采用免疫共沉淀法筛选获得相互作用蛋白PHB，该蛋白具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节自噬等作用，与Mtb感染后Mφ应答有关；采用Mφ细胞系、小鼠原代和BMDMs，明确NLRP3介导的c-di-AMP可促进Mφ免疫清除Mtb的作用；进一步建立了Mtb感染动物模型，明确NLRP3介导的c-di-AMP可抑制Mtb的胞内存活，但对Mtb持续感染并无抑制作用。综上， c-di-AMP作为细菌信号分子，对宿主NLRP3具有直接调节作用，还可调节Mtb NLRP3、自噬、休眠相关基因、代谢等多种基因表达。因此，c-di-AMP激活NLRP3对抗Mtb的作用涉及宿主和细菌双重因素。本研究进一步证实c-di-AMP对固有免疫和Mtb免疫相关抗原的双重调控作用。研究还发现c-di-AMP水平升高的rBCG免疫后可诱导IL-1β升高，其与一种新的免疫机制——训练免疫相关。本研究结果有助于c-di-AMP用于细菌感染的新药物和疫苗研究。