靶向钠离子通道Nav1.7的多肽设计算法开发

The voltage-gated sodium channels Nav1.7 is one of the best target for analgesic drugs. However, the analgesic “drugs” detected from natural peptide toxins are always without insufficient specificity and with great side effects. The artificial modification is necessary for increasing the specificity of the peptide to Nav1.7. However, it is too blind for the traditional peptide mutating experiment. Peptide design algorithm for targeting Nav specifically would be developed in this project. Combine the interaction of peptide toxins to Nav1.7 and the 3D structure of Nav1.7, a rapid screening algorithm would be developed according to the interaction probability of the short-peptides that many short peptides would not be considered as the low interaction probability. To this end, it is necessary to mine existing protein structure data, 1) constructing a short peptide flexible conformation database; 2) constructing a Bayesian probability model for short peptides interaction; 3) combining the data mining creations, 3D structures of Nav1.7 and the Multi-sequence alignments of Nav family; based on the concept of reactive group modification and orientation group construction, peptide design program which could target Nav1.7 specifically would be developed. Some designed peptides would be obtained by modeling screening; 4) peptide synthesis; patch clamp technique and cells with expressed heterologous Human Nav to verify the effect of these artificial peptides. The project has some levels of innovation in rational protein design for protein complex.

电压门控型钠离子通道Nav1.7是镇痛药物的极佳靶点，而从天然多肽毒素中寻找到的镇痛“药物”，专一性往往不够，副作用很大。为了增加多肽对Nav1.7的专一性，须进行人工改造，但传统的突变实验较为盲目。本项目将开发特异性靶向Nav的多肽设计算法。在与Nav1.7互作的多肽毒素基础上，结合其三级结构，依据短肽互作概率以快速筛查设计多肽。由于不考虑与短肽互作概率低的配对，故计算速度极大加快。为此，须对已有蛋白质结构数据进行挖掘，1）构建一个短肽柔性构象数据库；2）构建互作短肽的贝叶斯概率模型；3）根据前述成果、Nav1.7的三级结构及Nav家族的多序列比对，基于活性基团改造和定向基团构建的理念，开发靶向Nav1.7的多肽设计程序，并虚筛获得多肽；4）人工合成多肽，采用膜片钳技术，结合异源表达于细胞的人源Nav去验证人工多肽的效果。该项目在理性设计互作蛋白上，具有一定的方法创新。

本项目以电压门控型钠离子通道Nav1.7作为靶标分子，拟发展多肽药物的开发及设计方法。基于序列比对，我们发现了Nav1.7上潜在的、可以作为特异靶点的区域，计划以此作为双功能多肽药物设计的作用区域之一，结合非特异作用于Nav1.7活性中心的多肽毒素HWTX-IV，使其能够特异性地结合Nav1.7，成为副作用有限的镇痛药物。首先，我们构建了一个四肽构象数据库，通过Maestro的glide模块对Nav1.7的解析结构（PDB id：6J8G）完成了该特异区域的分子对接，共发现13,937个四肽都能很好地和目的区域对接；但这些四肽的作用特异性不足，因此这里仅仅是靶向Nav1.7的双功能多肽设计的起点。同时我们通过文献阅读，搜集了数百个作用于钠钾钙等离子通道的多肽毒素，并采 用Alphafold2完成了分子结构预测；这里主要是对作用于离子通道的多肽毒素的结构多样性进行探索；此外，我们也通过不同的转录组拼接算法比较，探索多肽毒素的拼接、识别方法，以获得更多的肽毒素；还通过肠道宏基因组的探索，发掘微生物的蛋白毒素功能及演化。然后，我们开发了程序包ARIP，并完成了近万个NMR结构的数据挖掘，提出了构象变化率等参数描述氨基酸残基相互作用的稳定性与柔性，以此构建了不同维度的氨基酸残基互作打分矩阵。该矩阵将用于上述对接的四肽筛选，以便能够选取合适的四肽，将其连接构建成特异性更高的多肽；后续还需要进一步构建linker设计算法，将其与针对Nav1.7活性区域的HWTX-IV连接成一个双功能多肽。整体上，该项目将作为综合应用开发多肽药物的起点，涉及活性多肽的发现、结构预测、靶点发现等；多功能的多肽构建以增加特异性，减少副作用等；同时也对蛋白质中的氨基酸残基互作的倾向性等基础问题展开了一系列研究，最终希望能够开发出具有通用性的多肽药物设计方法及验证体系。