染色体域空间构象的三维荧光原位杂交的量化表征

As an important carrier of genome, chromosomes play vital roles in the functions of nucleus and genetic variation. Current models of nuclear architecture of mammals showed that chromosomes in the cell nucleus are organized as chromosome territories (CTs) occupying discrete domains. The spatial conformation of CTs is significant for understanding the regulation of gene expression at the topological level, and the changes in nuclear organization that occur during cellular differentiation. In recent years, more and more evidences that genetic and epigenetic modifications result in the spatial conformation variation of CTs, leading to the formation of tumors by abnormal gene expression. The experimental method of spatial conformation of CTs and specific gene localization is critical to these key problems research. In this project, we will develop a quantitative method which combines with three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH), fluorescence imaging and image reconstruction techniques to measure accurately the spatial conformation of chromosome territories in nucleus without changing the original shape of cell. This method might provide a new approach to study the normal chromosome territories and aberrant ones, help to distinguish chromosome translocation, trisomy, and gene location, and contribute to understand the relationship between CTs variation and disease, such as leukemia.

染色体作为基因组的重要载体，是细胞核结构的重要组成单元。染色体在细胞核中占据一个明显的区域，称为染色体域。染色体域在细胞核内的空间构象信息，对于细胞核内部复杂生命过程（特别是遗传与变异）的研究非常重要。肿瘤的形成受遗传学修饰和表观遗传修饰的影响，这些修饰引发染色体域的空间构象变异，从而导致基因表达异常。染色体域构象及其特定基因的空间定位的实验方法对这些关键问题的研究至关重要。本项目拟结合三维原位荧光杂交 (3D-FISH)、荧光成像和图像重构技术，在不改变细胞原始形态情况下，原位、精确地测定染色体域在细胞核内的三维空间位置及其形貌，并通过统计分析，给出各个染色体域之间的相对位置关系、空间分布规律等构象信息。这种三维、量化表征方法有助于研究细胞内染色体域的正常空间构象与构象变异，将为识别染色体的异位、三体性、基因定位等，以及研究染色体域构象变异与疾病(如白血病)的关系提供一种新的途径。

染色体是细胞核内遗传物质存在的基本形式。正常情况下，染色体在有丝分裂间期细胞核内的空间位置分布是相对稳定的。染色体在细胞核内的三维构象与基因表达调控、表观遗传学调控等密切相关。染色体构象的不稳定是许多重大疾病（如癌症）的根源，几乎所有癌症患者都伴随有染色体构象的异常，包括染色体的缺失、复制、断裂、易位以及倒位等等。.本项目以人的骨髓和外周血中的单个核细胞为研究对象，建立了三维荧光原位杂交技术（3D-FISH），标记细胞核内的相关染色体（8#与21#，15#与17#），应用激光扫描共聚焦显微成像技术，以及图像重构技术，在不改变细胞原始形态的情况下，原位再现细胞核内染色体的空间构象及其分布。并进一步通过统计分析，给出各个染色体之间的相对位置关系、空间分布规律等构象信息。依据构象特点，将细胞分类为正常细胞、相随细胞以及恶性细胞。建立了一种简便实用的3D-FISH “双色五标”新方法。.将建立的3D-FISH方法直接应用到急性髓系白血病t(8;21)(q22;q22)/M2以及t(15;17)(q22;q12-q21)/M3两类亚型患者的临床研究。通过连续追踪患者的病情发展，研究了不同临床阶段，尤其是复发前，患者骨髓中染色体三维构象的变化规律。观测到患者在复发前期，恶性细胞比例已经缓慢上升。当恶性细胞比例约大于20%时，易发生复发，比目前临床的检测指标提前3-4个月提出预警。这对患者的及时治疗，以及临床监测疾病发展提供了有效信息。.本项目分析了M2以及M3亚型患者骨髓中的单个核细胞，其有丝分裂间期染色体的空间位置分布特点。探究了患者出现血液学复发前，染色体空间位置的变化规律，初步推测染色体在间期细胞核内的空间位置出现中心化，是染色体发生易位以及促使患者复发的原因之一。这对临床病理研究有重大意义。.我们研究了染色体的三维构象在多组白血病患者的骨髓和外周血中的异同，为外周血能否代替骨髓做临床白血病诊断，提供了信息。.本项目的研究成果为临床白血病患者提供一种复发预警的潜在手段，有利于临床专家进一步研究白血病复发机理。