偶联序列条形码单链标签扩增的多重核酸传感器研究

Although methods for pathogen detection based on nucleic acid analysis have advantages of high sensitivity and high specificity, they have drawbacks such as the requirement of complex instruments and cumbersome operation, making it difficult to achieve rapid field testing and multiplex screening. We have previously established an immunochromatography-based nucleic acid sensor with an internal amplification control , which realizes the semi-quantification of over 1000 copies/mL of HBV DNA in clinical samples. However, our method has the difficulty in simultaneously detecting multiple targets. According to our previous work, in order to achieve a novel technology for highly efficient multiplex amplification, we propose a DNA sensor based on the amplification of sequence-barcoded single tags and a new strategy for primer design based on polymerase preference index. With our proposed method, amplicons from each target will carry a specific sequence-barcoded single tag through a single tube amplification. Coupled with a DNA hybridization sensor, amplicons with a single tag can directly hybridize with specific capture probes, then appear as a visible band at the corresponding position on the sensor. Therefore, our work will achieve the low-cost visual detection of multiple targets, providing a new powerful tool for rapid field screening and identification of pathogens in clinic.

基于核酸检测的病原体筛查方法具有灵敏度高、特异性好的优点，但检测过程操作繁琐、所需仪器价格昂贵，难以实现现场快速检测与多重组合筛查。为此，在前期工作中我们建立了基于免疫层析的内控核酸检测方法，实现了对大于1000拷贝/mL的乙肝病毒样本的半定量测定，然而，该方法难以同时检测多个靶标。本项目在前期工作基础上，通过提出序列条形码单链标签扩增方法和基于聚合酶亲和指数的引物设计新方法，建立高效多重扩增新技术，通过单管一次扩增，使各目标产物附带上特异性的单链标签序列。将此扩增技术与核酸杂交传感器相偶联，扩增产物直接与传感器上特定的捕获探针高效率杂交，并在传感器相应位置出现肉眼可见的色带。该传感器可实现同时对多个待测靶标进行低成本可视化检测，为病原体现场快速检测与筛查提供了新的有力工具。

随着生物技术的高速发展，核酸扩增检测技术（nucleic acid amplification test, NAT）在病原体鉴定中越来越多地发挥了重要作用。目前，应用最广泛的核酸检测技术是实时荧光定量PCR，但其所需试剂仪器价格昂贵，难以在基层卫生检疫部门和边远地区得到普及。为了建立一种低成本的快速核酸检测技术，本课题组前期建立了结合PCR扩增方法和胶体金免疫层析技术的核酸试纸条传感器，并将其应用于乙型肝炎病毒的检测。但传统的免疫捕获传感器单次检测靶标数量有限，难以对多个核酸靶标进行同时检测。因此，为实现多重的核酸可视化检测，本课题在侧流层析免疫分析技术的基础上引入了集成DNA杂交检测技术，构建了标记多种序列条形码捕获探针的核酸传感器，并用于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）、梅毒螺旋体（Treponema Pallidum，TP）四种血液病毒的检测。. DNA 杂交检测是基于单链捕获探针与单链靶标的杂交反应，在检测之前需要对PCR产物进行变性处理，形成单链结构后再与捕获探针反应。而由于互补链竞争等因素存在，常规的核酸杂交效率不高，导致方法的灵敏度偏低。因此，本课题建立了一种新的引物设计方法，使核酸扩增产物末端带有一段单链序列标签，可与传感器上的捕获探针进行高效杂交反应。同时，本课题还建立了多重单链序列标签PCR 扩增法，实现了多个靶标的同时高灵敏度检测。. 为进一步降低检测成本，本课题研制了可对不同靶标组合进行检测的通用型传感器。当该传感器应用于检测其他靶标时，仅需要在对靶标扩增时引入相应的序列条形码标签即可，而无需根据检测靶标再次设计新的捕获探针。其各检测线间无交叉反应，特异性良好，且检测灵敏度远高于琼脂糖凝胶电泳。该方法可对多个血液病毒核酸靶标进行同时检测，并且具有高灵敏、高特异、易使用、低成本、用时短等优点，适用于血液病毒安全性筛查等领域的POCT检测，为病原微生物的现场快速检测提供了新的有力工具。