必需调控系统PhoPQ快速起源及与细菌有丝分裂的调控关系

The two-component signal transduction system PhoP-PhoQ is a critical regulatory mechanism in controlling expression of bacterial virulence factors. Among them, phoP encodes a cytoplasmic response regulator whereas phoQ encodes a membrane-bound histidine kinase. Previous investigations have revealed that phoP-phoQ genes are highly conserved between two close-relative phytopathogenic bacteria: Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) and X. campestris pv. campestris (Xcc). However, in Xoo, phoP-phoQ are mutatable and non-essential genes, wherease in Xcc, phoP-phoQ are bona fide essential genes that cause lethal phenotype and abnomality of cellular mitosis after being mutated. These results suggested that an accelerated evolution taken place for phoP-phoQ in Xanthomonas.In order to deciphering the molecular basis of phoP-phoQ evolution, the present project will employ genetic and comparative transcriptomic methods to identify the consensus sequences which are the cis-regulatory elements of transcription factor PhoP. Based on this result, the differences between regulons of PhoP of Xcc and Xoo will be compared. By identifying the downstream essential gene that is specifically modulated by PhoP of Xcc, the project will reveal the fundamental role of rewiring between transcription factor and cis-regulatory elements during the accelarated evolution of essential genes. The results of this project will have broad interest for understanding the origin of novel regulatory genes and evolution of bacterial pathogens.

phoP-phoQ分别编码反应调节蛋白和组氨酸激酶，是调控细菌致病因子表达的关键双组分信号转导系统。前期研究发现：在水稻黄单胞菌（Xoo）中，phoP-phoQ是非必需基因。而在极近缘的野油菜黄单胞菌（Xcc）中，phoP-phoQ是必需基因，突变后细胞分裂异常、致死，表明phoP-phoQ及其调控功能发生了快速分化。为解析该进化现象的分子机制，项目拟利用比较转录组学和分子遗传分析方法，在Xcc和Xoo中筛选、鉴定与转录因子PhoP发生直接相互作用的顺式调控元件，对比PhoP-PhoQ调控元的差异。在此基础上，通过异源表达、蛋白磷酸化和突变分析等方法，探索在PhoP-PhoQ调控功能的快速分化过程中，转录因子-顺式调控元件重联接（rewiring）和在细菌有丝分裂中的调控机制，阐明在Xcc中，phoP-phoQ进化为必需基因的原因。研究将为新调控基因的起源和病原细菌的快速进化提供分子基础。

必需基因（essential gene）是对细胞生命活动至关重要，突变后会导致生物死亡或不育的基因。病原细菌的必需基因可作为药物分子设计的理想靶标。过去认为，必需基因受功能限制和自然选择的强烈作用，在进化上应比较保守，其在功能上发生重要进化需要通过基因重复等方式解除自然选择的压力。然而，通过实验分析，已经在各类物种中发现了快速进化的必需基因，表明必需基因的进化速率并不一定保守，有必要对其进化的分子生物学机制进行深入探索。.前期研究发现多数革兰氏阴性菌，包括植物病原菌水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）中，phoP-phoQ基因可以被突变，是非必需基因。phoP-phoQ编码一个调控细菌致病力的双组分信号转导系统。然而，在十字花科黑腐病病原菌－野油菜黄单胞菌（X. campestris pv. campestris, Xcc）中，phoPXcc-phoQXcc难以通过常规遗传学方法被敲除，可能是一对发生了快速进化的必需基因。本研究首先利用严谨的遗传学分析方法，证明在Xcc中phoPXcc-phoQXcc是必需基因：只有通过质粒反式提供额外的、具有功能的基因拷贝时，染色体上的phoPXcc-phoQXcc基因才能被成功突变。如果质粒基因拷贝的转录被抑制，会导致突变体生长完全停滞，影响细菌的繁殖。通过ChIP-seq技术分析了PhoP在磷酸化和非磷酸化状态下的调控元，发现PhoP在磷酸化状态下调控更多的靶基因，其中包括phoP自身和oar基因。基于上述分析，预测PhoP结合的一致序列为[(T/C)(T/C)GT(T/G)CA(G/A)]。通过EMSA和DNase I footprinting分析证明了该位点确实是PhoP的结合序列。.研究利用PhoP结合一致序列在Xcc 8004、Xoo PXO99及铜绿假单胞菌PAO1基因组上搜索了可能的结合序列，发现即使是在Xcc和Xoo这两个极近缘的基因组中，PhoP结合序列的数量和位置均发生了较大的变异，它们的PhoP共有的同源基因仅75个（约总数的30%）；铜绿假单胞菌PAO1基因组上PhoP结合的序列多于黄单胞菌，且数量和位置变异的程度更明显，这些结果表明在物种分化过程中，PhoP-PhoQ系统及其调控元发生了剧烈的变异和分化，从而使细菌能够适应特殊的环境。上述结果为转录因子