VI型分泌系统介导假单胞菌JY-Q尼古丁耐受机制的研究

Pseudomonas species are the commonly-used bacteria for studies on nicotine bio-degradation, and we isolated Pseudomonas sp. JY-Q with high nicotine tolerance (10 g/L) and degradation efficiency (5 g/L, 24h) from tobacco waste extract (TWE). Pseudomonas sp. JY-Q could have evolved specific genetic patterns to adapt to high nicotine concentration niches, such as the expression of T6SS (type VI secretion system) genes present up-regulated, contributing to its fitness under the nicotine circumstance and ROS stress. T6SSs play versatile roles in the cell-cell communication and bacteria-host interplay, population cooperation, and underlying signal transduction and kin selection activities. T6SSs are a class of sophisticated cell contact-dependent mechanisms involved in mediating antagonistic or synergistic communications between bacteria and/or bacteria and eukaryotic cells as well as niche advantages. However, the extract mechanisms of T6SS influencing nicotine metabolic capacities need clarification. In terms of T6SS capable of influencing population density, antimicrobial functions, bacterial resistance as well as membrane transport, we plan to characterize the association between T6SS and nicotine metabolism by interpreting T6SS and cognate effector functions.

假单胞菌是研究微生物降解机制的常用菌株，本项目组从废烟草水提液（TWE）中分离得到一株尼古丁耐受能力达10 g/L和高降解活力（5 g/L，24h）的假单胞菌JY-Q。前期转录组学和基因功能研究发现，JY-Q尼古丁高耐受性与其独特的基因组结构和VI型分泌系统相关（T6SS表达在尼古丁存在时呈上调趋势，T6SS突变株在同等条件下相较野生菌生长较差）。进一步发现这种相关性是与T6SS介导的ROS耐受能力有关。T6SS是介导细菌胞体间通讯和互作的重要方式，也是参与细菌与宿主之间致病、共生，细菌间抑制、互作并且与细菌抗逆性、膜运输外排相关的功能元件，相关进展表明T6SS分泌蛋白在上述过程中发挥了重要效应。因此本研究首先通过组学技术筛选T6SS分泌蛋白，运用构建T6SS相关组件和T6SS分泌蛋白编码基因突变株的策略，功能解析T6SS参与假单胞菌尼古丁耐受能力的分子机制用于生态修复。

尼古丁由于化学结构包含吡啶和吡咯烷的含氮杂环，难于降解且危害人体健康，破坏生态环境。微生物法降解尼古丁是一种绿色、环保、高效的生态修复方式，其降解方式主要包含：吡咯烷（PRL）、吡啶（RD）、吡啶-吡咯烷变异VPP途径。Pseudomonas sp. JY-Q分离自废次烟叶水提液（tobacco waste extract，TWE，尼古丁含量~20 g/L），对尼古丁具备较强的耐受性和降解能力（5 g/L, 24 h；耐受高达10 g/L）。因此阐明其尼古丁代谢和耐受机制，对微生物降解污染物基础研究和潜在应用具有重要的参考意义。本项目基于比较基因组学、基因敲除、酶学分析等分子生物学实验，聚焦VI型分泌系统（T6SS）响应和调控尼古丁压力的机制规律。研究表明：（i）T6SS动态响应不同尼古丁浓度，T6SS缺失突变株耐受尼古丁能力下降；（ii）依托比较分泌组学和分子生物学，鉴定出一个响应尼古丁压力的T6SS新型效应蛋白TseN；（iii）构建组合型基因敲除突变株，定量鉴定JY-Q代谢尼古丁的功能模块(Nic1-Spm-Nic2)；（iv）依托体外表征和代谢分析，鉴定出TseN通过调节与尼古丁脱氢过程相关的NAD+稳态，形成对尼古丁及其代谢过程氧化胁迫的耐受能力。本项目以基因组学为导向，揭示了JY-Q具备高效尼古丁降解能力的代谢架构和遗传基础以及T6SS影响尼古丁代谢分子机制；上述研究为后续采用合成生物学手段进一步强化JY-Q的耐受和降解尼古丁能力以期应用于TWE的实际场景，提供了关键的修饰靶点和功能元件。