细胞因子Tetherin功能及其抗HIV病毒作用研究

Tetherin蛋白是上世纪90年代发现的一种细胞因子，2008年被发现还具有广谱的阻止逆转录病毒（如HIV）、丝状病毒(如埃博拉、拉沙热)等包膜病毒释放的功能，可能为a-干扰素诱导的抗包膜病毒的天然免疫形式之一。然而Tetherin细胞因子的固有功能究竟是什么，Tetherin捕获和内化新生的包膜病毒粒子的机制是什么，两者之间是否存在联系等等，这些问题都还是未知。本项目拟通过比较克隆的各多态性Tetherin蛋白的抗HIV-1病毒能力的差异、亚细胞定位路线受HIV感染影响的情况，最终确定出参与抗病毒作用和不参与抗病毒作用的两种类群的Tetherin蛋白，即代表抗病毒因子的Tetherin类群和仅代表细胞因子功能的Tetherin类群。解析Tetherin两种功能之间的联系。希望可以籍此推导出Tetherin蛋白由细胞因子 "演变"成抗病毒因子的机制。

首先我们克隆了人和非洲绿猴的Tetherin蛋白cDNA，测序结果显示非洲绿猴的Tetherin蛋白具有两种形式：67R 和67H。进一步构建了各型Tetherin的表达质粒，将与包含有YFP荧光的Vpu缺失的HIV-1或者含有Vpu序列的HIV-1假病毒表达质粒共转染，荧光显微观察的结果以及Western Blot的结果一致表明：人的Tetherin蛋白只能有效的阻止Vpu缺陷型的HIV-1病毒颗粒的释放，而67R和67H两种形式的非洲绿猴Tetherin蛋白即可有效阻止Vpu缺失的HIV-1病毒颗粒的释放，又可有效抑制含有Vpu的HIV-1病毒颗粒的释放。暗示了Vpu并不能降解67R和67H两种形式的非洲绿猴Tetherin蛋白，导致非洲绿猴Tetherin蛋白对HIV-1的复制具有较强的限制功能。我们将进一步通过蛋白之间的相互作用验证这一结论。 . 在上述材料的基础上，结合学科组的优势，我们以pNL4-3质粒为基础骨架，构建了包含CRF07_BC、CRF08_BC及B’亚型的 Vpu和Vpu基因knock down的HIV-1感染性毒株，对中国境内主要流行的HIV-1毒株Vpu与Tetherin的拮抗情况进行了研究。包含不同亚型Vpu的病毒复制曲线及致细胞病变情况的研究结果显示含有CRF08 Vpu序列的HIV毒株的复制能力更强，表明其更有利于促进HIV子代病毒的扩散。在C8166 T细胞中其致细胞病变效应方面，各亚型之间不存在明显的差异。进一步从其作用于Tetherin进而影响病毒释放的结果来看，NL4-3 Vpu更为敏感，更能有效的增强病毒的释放。各亚型Vpu与Tetherin之间详细的分子生物学作用关系还需进一步验证。 . 最近有报道显示Vpu与CAML之间也存在直接的蛋白相互作用，既然Vpu与Tetherin，Vpu与CAML都具有直接相互作用，那么CAML是否参与了Tetherin对HIV病毒复制的调控途径进行了研究，首先我们验证了Tetherin和CAML之间的互作关系。结果表明二者之间不存在直接的蛋白相互作用。 . 我们将继续对上述的结果进行进一步验证和深入探讨，明确Vpu蛋白与宿主因子Tetherin之间的分子生物学关系，为探索如何控制病毒复制提供新的思路。