钙离子介导的HIV-1 Vpu拮抗Tetherin作用机制的研究

Tetherin is a natural host antiviral factor,it restricts virus by tethering viral particles to the infected cell surface through its transmembrane domain and Glycophosphatidylinositol(GPI) anchor, and prevents virus release. HIV-1 Viral Protein U(Vpu)efficiently antagonizes this antiviral activity, but the mechanism is still controversial. This proposal is based on existing theory and preliminary research data, and presents a new interpretation for conteraction mechanism between Vpu and tetherin. Vpu interacts with TASK channel protein, causes changes of cell surface potential and triggers voltage-dependent calcium channel (VDCC), leading to calcium influx, which activates phospholipase C (PLC) to remove GPI modification of tetherin anchor and eliminate its antiviral activity. Simultaneously, inositol triphosphate (IP3) signal would be released, resulting in further enhanced intracellular calcium concentration and a cascade effect,which would enhance the effect of PLC's modification. This proposal would address through intervention of calcium regulating agent, isotope tracing and RNA interference experiments to confirm the contribution of GPI modification and the blocking effect of PLC and calcium ions to the tetherin function, and reveal a Vpu-induced calcium-mediated tetherin antagonism pathway. It would explain the molecular mechanism of Vpu enhanced virus release from a new angle, and provide new ideas and novel targets for anti-Acquired immune deficiency syndrome (AIDS ) treatment.

Tetherin是人体细胞天然存在的抗病毒因子，其抗病毒机理是通过穿膜区和锚定区将新生病毒颗粒束缚在被感染细胞表面，阻止病毒释放，其抗病毒作用可被HIV-1 Vpu拮抗，机制目前尚有争论。本课题基于已有理论及前期研究基础，对此问题提出一种新的解释。即Vpu通过与TASK通道蛋白相互作用引发细胞表面电位变化，触发电压依赖性钙通道（VDCC），导致钙离子内流，激活磷脂酶C（PLC）切除Tetherin的锚定区GPI修饰，使其抗病毒活性丧失，同时释放三磷酸肌醇（IP3）信号，进一步提升胞浆钙离子浓度，产生级联放大作用。本课题将通过钙离子调控剂干预、同位素示踪和RNA干扰等实验手段证实GPI修饰对Tetherin功能的影响及PLC和钙离子对其功能的阻断作用，揭示一条通过钙离子介导的Vpu拮抗Tetherin作用途径，从一个全新角度阐明Vpu增强病毒释放的分子机制，为抗艾滋病治疗提供新思路和新靶点。

Tetherin是细胞中一种具有独特跨膜拓扑的II型跨膜蛋白，能够限制包括HIV-1在内的多种包膜病毒繁殖产生的子代病毒从被感染的宿主细胞中释放出来。HIV-1VPU能够拮抗宿主限制因子Tetherin的限制作用从而增强病毒的传播。VPU拮抗Tetherin的分子机制初步认为：VPU诱导Tetherin的降解或者下调Tetherin细胞表面表达量。我们在本项目中提出VPU可能通过其跨膜区的特殊性质，诱导宿主细胞内钙离子浓度上升，从而激活某些钙离子依赖的下游通路进而拮抗Tetherin的抗病毒活性的假说，并以一系列实验对此假说的几个方面进行了验证。我们通过Fluo-4钙离子荧光指示染料作为监测细胞内钙离子浓度的变化的方法，配合以荧光显微镜、荧光分管光度计以及流式细胞分析，对表达VPU的宿主细胞内钙离子浓度进行检测，得出明确结论：VPU能够提升宿主细胞内钙离子浓度。我们进一步通过多种抑制剂实验以及siRNA沉默实验，配合以病毒释放测试，确定了VPU提升宿主细胞内钙离子浓度的能力是依赖于T型电压依赖的钙离子通道的，并且与VPU消除Tetherin限制释放的活性相关。我们通过定位诱变等方法，证明VPU提升细胞内钙离子浓度的机制是通过与TASK1相互作用。对于被VPU提升的细胞内钙离子可能通过哪种方式来起到拮抗Tetherin的作用，我们也进行了多方面探索，通过免疫共沉淀实验确认VPU不影响Tetherin与出芽病毒的共定位。同时，我们初步发现VPU可能通过激活MMP等水解酶切割Tetherin从而消除其限制活性，而磷脂酶PLC和PLD介导的作用则相对微弱。进一步的实验还发现，VPU通过T-VDCC介导的钙离子浓度升高，可以干扰Tetherin的HemITAM motif磷酸化而抑制Tetherin的NF-kB活性。综上所述，我们通过多种研究手段，初次证明了一种钙离子介导的VPU拮抗Tetherin的新分子机制的存在，并对这种机制中的主要信号传导途径进行了阐明。