miR-146a/b在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的作用及分子机制

Mastitis is one of the complex diseases caused by pathogens, the molecular mechanism is not clear. Previous study showed that miR-146a/b could regulate immune response for human and model organisms, and played an important role in the process of many inflammatory diseases. The results of preliminary experiments showed that bovine miR-146a/b might regulate inflammatory reaction in mammary epithelial cell, which need to be further confirmed. In this study, the target genes of miR-146a/b will be identified by dual-luciferase reporter assay system.The inflammatory reactions in bovine mammary epithelial cells were induced by LPS (Lipopolysaccharide) or LAT (lipoteichoic acid). On this basis, the methods of over-expression and gene silencing, quantitative PCR and immunofluorescence, flow cytometry will be used for carrying out the experiments as follows: spatio-temportal expression of miR-146a/b during the process of inflammatory reaction in mammary epithelial cells will be detected. Furthermore, the effects of miR-146a/b on mRNA and protein expressions of target genes, its signaling pathway genes and inflammatory cytokines in mammary epithelial cell will be analyzed. Finally, the effects of miR-146a/b on cell morphology, proliferation and apoptosis will be detected. The results of this project will reveal the function and molecular regulation mechanisms of miR-146a/b for inflammatory reaction in bovine mammary epithelial cells, which will be the foundations for clarifying the mastitis molecular regulation network and for mastitis resistance molecular breeding.

乳房炎是受病原体感染所致的复杂疾病，其分子机制尚不完全清楚。已经证实人和模式生物miR-146a/b可调节免疫反应，在多种炎症性疾病中起着重要的调控作用。前期实验结果初步表明miR-146a/b可能对奶牛乳腺上皮细胞炎症反应有调控作用，有待于进一步证实。因此，本项目拟采用双荧光素酶报告基因技术鉴定miR-146a/b的靶基因；利用脂多糖或磷壁酸诱导乳腺上皮细胞产生炎症反应，在此基础上，采用基因过表达、基因沉默、定量PCR、免疫荧光、流式细胞等技术，检测miR-146a/b在乳腺上皮细胞炎症反应过程中的动态表达；研究miR-146a/b对靶基因及其信号通路基因、炎症因子的mRNA和蛋白质表达水平的影响；并检测miR-146a/b对细胞形态、增殖与凋亡的影响。研究结果将阐明miR-146a/b在乳腺上皮细胞炎症反应中的作用及分子机制，为奶牛乳房炎的分子调控网络解析和抗病分子育种奠定基础。

摘要.本研究采用细胞培养、双荧光素酶报告基因、基因超表达与沉默、定量PCR、Werstern-Blotting、流式细胞等技术研究了miR-146a/b在乳腺组织和乳腺上皮细胞（BMECs）中的表达模式，阐明了miR-146a在奶牛BMECs炎症反应中的分子作用机制，获得了如下主要结果：.1、表达模式研究：miR-146a/b在临床乳腺炎和实验性乳腺炎（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别感染）的奶牛乳腺组织中的表达量均显著上调。此外， miR-146a在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别感染奶牛乳腺的不同时间（第0、1、3、5和7 d）血液中表达量均低于miR-146b的表达量，且两个miRNA在组内不同时间点的表达量差异均不显著，可见他们在血液中表达量与奶牛乳腺炎不相关。.2、靶基因鉴定：构建3´UTR双荧光素酶报告基因载体，转染293细胞，测定酶活，结果显示TLR4/NF-κB信号通路关键分子TLR4和TRAF6为牛miR-146a的靶基因。.3、分子作用机制研究：（1）体外培养BMECs，利用miR-146a过表达和沉默实验首次证实了miR-146a可靶向抑制TLR4、TRAF6及信号通路下游关键核转录因子NF-κB的mRNA和蛋白质的表达。（2）LPS诱导BMECs产生炎症反应，使得细胞内miR-146a的表达量显著升高。过表达和沉默实验结果表明miR-146a可抑制LPS诱导的BMECs内炎症因子IL-6、TNF-α和IL- 8基因的表达和分泌。已有研究表明NF-κB是miR-146a、IL-6、TNF-α和IL-8基因的关键转录因子，因此，我们得出结论，LPS刺激BMECs，通过TLR4/NF-κB信号通路使NF-κB活化，从而导致miR-146a表达量升高，高表达miR-146a又负反馈靶向抑制TLR4和TRAF6基因表达，从而抑制了信号通路下游NF-κB的表达，使得炎症因子IL-6，TNF-α和IL-8的表达和分泌降低，从而调节了整个炎症反应和免疫应答过程。.4、细胞转染和流式细胞实验结果显示，miR-146a可导致BMECs形态发生变化，并促进了BMECs凋亡。.本研究结果首次阐明了牛miR-146a在BMECs炎症反应中的分子作用机制，为奶牛乳房炎的分子调控网络解析提供了可信的研究资料，为奶牛乳腺炎抗性育种奠定了基础，具有潜在的应用价值。