M1与DNA-PKcs相互作用对流感病毒复制的影响

‘Flu’ is a severe disease that causes illness and deaths of human and animal every year around the world. In order to reduce damage caused by influenza infection and transmission, new anti-viral drug targets are urgently needed. Through studying viral-cellular protein-protein interactions (PPIs) could improve our understanding of how influenza viruses inhibit host immune response, hijack the cell machinery and benefit their replication and transmission, and therefore viral proteins and cellular proteins which are necessary for virus infection and replication would become potential drug targets. .According to our preliminary data, we found influenza matrix protein (M1) could specific binds to the DNA dependent kinase catalytic subunit (DNA-PKcs). DNA-PKcs not only plays a critical role in non-homogenous end joining and V(D)J recombination, but also initiates native immune response and regulates cell death. DNA-PKcs function as an antiviral factor is an emerging concept. Based on the concept, we are trying to understand the biological meaning behind the interaction between M1 and DNA-PKcs and also provide fundamental research data for new anti-viral drugs screening.

流行性感冒是由流感病毒引起的一种重要疾病，严重时可以导致死亡。 病毒的高频率变异导致流感病毒出现了越来越严重的抗药性。为了降低流感病毒带来的健康危害，需要研制新的抑制病毒复制的药物。我们研究发现A型流感（WSN/33）M1蛋白能够和宿主DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）特异性结合。最近研究发现，DNA-PKcs具有调控细胞自身免疫的功能。 本项目通过研究病毒M1蛋白和宿主细胞DNA-PKcs蛋白之间的相互作用作为一个切入点，试图在分子水平上解释病毒和宿主细胞免疫系统之间的关系。并为新药物的筛选提供理论基础。

本次研究拟通过揭示M1蛋白和DNA-PKcs相互作用对流感病毒复制的影响，并进一步研究病毒M1蛋白与其他几种宿主细胞蛋白之间的相互作用关系。通过项目三年的运行，基本完成了项目的任务内容，取得了如下研究成果：1、通过免疫共沉淀的方法成功验证了流感病毒M1蛋白与DNA-PKcs蛋白确实存在相互作用。2、在DNA-PKcs抑制剂的作用下，流感病毒的复制水平显著升高。3、成功构建M1磷酸化位点点突变的质粒，并成功拯救出病毒，检测拯救出的病毒株复制情况，结果显示，M1磷酸化位点点突变对流感病毒的复制没有显著影响。4、成功利用CRISPR/Cas9技术，构建DNA-PKcs敲除的293T细胞系。5、与野生型细胞系相比，在DNA-PKcs敲除的293T细胞系中流感病毒的水平有所提高。6、核糖体蛋白 S3（RPS3）是 NF-κB 复合体的必需功能亚单位，RPS3可以磷酸化后激活NF-κB信号通路，前期实验证明AM1与RPS3存在相互作用，本研究通过构建结构域缺失的AM1蛋白与RPS3敲除的293T细胞系，结果显示AM1与RPS3相互作用的结构域为N区域（1－67），L区域（68－87），M区域（87－165），RPS3缺失，流感病毒复制水平升高。7、M1蛋白具有型特异性，为进一步探讨不同型流感病毒的M1与相关宿主蛋白间相互作用的差异是否可能是造成不同型流感病毒毒力及宿主易感性差异的原因，利用荧光素酶拆分互补法（ SLCA ）检测不同型流感病毒的M1蛋白与宿主蛋白Hsp70、Hsp90、eEFia（这三种蛋白已经确认过与M1存在相互作用的）之间相互作用差异，结果显示不同型流感病毒的M1与相关宿主蛋白间相互作用存在差异。综上所述，本研究实验结果显示M1蛋白与很多宿主蛋白存在相互作用，并且这种相互作用可以影响流感病毒的复制，其中DNA-PKcs在流感病毒在宿主体内复制过程中发挥着重要的作用，但是M1蛋白HTPSSS基序的磷酸化对流感病毒的复制无显著影响，由此推断，DNA-PKcs对流感病毒复制的抑制作用不是由其对M1蛋白磷酸化造成的。本项目探讨了宿主蛋白DNA-PKcs对流感病毒复制的影响，并进一步研究了其他宿主蛋白与流感病毒M1蛋白相互作用情况，基本达到了项目的预期目标。