骨髓间充质干细胞再程序化的多潜能干细胞的制备、定向分化为功能神经细胞的体外和体内实验研究

自体骨髓间充质干细胞(MSCs)跨胚层分化为神经细胞的效力不高、比例低下,离临床应用还有相当的距离。本课题采用慢病毒转染技术将神经分化中起关键作用的转录因子ngn2基因转染大鼠MSCs细胞，改变细胞的发育"记忆"， 使MSCs再程序化为iPS多潜能干细胞，经诱导跨胚层定向分化为功能神经细胞。使用免疫细胞化学、Western blot、膜片钳电生理技术体外研究神经细胞的形态、功能和分化比例；体内移植实验采用免疫组化、神经传导束示踪技术和BBB运动功能评分等方法定量评价iPS多潜能干细胞存活、分化、迁移以及损伤区神经结构修复和功能恢复。预计结果将提高自体MSCs跨胚层分化为神经细胞的效力和比例,为移植治疗中枢神经系统损伤提供理想的种子细胞，解决移植治疗中供体不足与配型困难等瓶颈问题,为脑脊髓损伤、脑中风等一类难治性疾病的治疗提供新的方法。因此, 本课题的实施具有深远的理论意义和临床应用价值。

骨髓间充质干细胞存在于骨髓，脂肪组织和外周血等体内多个部位,在适当条件下，可分化为多种细胞：包括神经元，脂肪细胞，软骨细胞，骨骼肌细胞，肝细胞和心肌细胞等。但是其跨胚层分化为神经细胞的效率较低，而且越来越多的证据表明只有少数移植的MSCs可在宿主脑内存活，也没有长期存活的报道。在注射至宿主大脑后，MSCs常保持其未分化状态且不与宿主细胞产生联系，所以必须找到一种新的有效的方法使MSCs向神经元转化。本课题将在中枢神经系统发育中起关键作用的基因—Ngn2通过慢病毒的方法转染至MSCs。在体外研究中，Ngn2-MSCs重编成为神经前体细胞，并在神经分化培养基的诱导下分化为神经细胞，这些细胞表达神经元特异性标志物（NeuN，MAP2和β-tubulin III）且具有电压门控性Na+通道.体内试验中，将Ngn2-MSCs、GFP-MSCs和MSCs移植至大鼠stroke模型中（右侧大脑中动脉阻断模型），Ngn2-MSCs显著减少了缺血大脑中的凋亡细胞数目和梗死面积。另外，移植的Ngn2-MSCs填补了缺血大脑中的细胞数且显著改善了大鼠运动功能。.这些结果表明Ngn2转染可在体外和体内将MSCs再程序化为神经元，移植Ngn2-MSCs对stroke大鼠具有很好的治疗效果。