ER-SNARE在种子储藏蛋白质转运中的功能分析

高等植物种子储藏蛋白质储存在蛋白质储藏型液泡中，为种子萌发和初期生长提供氮源。种子发育过程中，储藏蛋白质经历合成、运输、加工和储藏等一系列过程，这些过程影响着种子蛋白质的含量和质量。为了探讨种子储藏蛋白质运输机制，我们制作了一系列模型植物拟南芥的储藏蛋白质运输异常突变体并进行了相关基因的功能研究，我们的前期工作发现，在maigo2突变体种子细胞中，储藏蛋白质前体不能被有效运离内质网而异常蓄积于内质网腔中，导致新型细胞结构MAG2 Body的形成。MAIGO2 能和ER-SNARE蛋白AtUfe1和AtSec20相互作用，可能促进高尔基体和内质网间的囊泡运输。为了进一步阐明内质网和高尔基体间储藏蛋白运输机制，我们拟利用突变体进行表型分析，结合分子生物学、细胞生物学和生化学等手段，从多个角度对MAIGO2相互作用因子AtUfe1和AtSec20的功能及各因子间功能相关性进行深入分析。

本项目旨在初步揭示内质网和高尔基体间蛋白质运输过程中拴系复合体与SNARE复合体之间的作用机制。我们利用突变体和转基因植物进行表型观察，结合分子生物学、细胞生物学和生化学等手段，从多个角度对MAG2复合体和相互作用因子AtUfe1和AtSec20的功能及各因子间功能相关性进行了深入分析。基本完成了研究内容和各年度计划，实现了研究目标。首先，发现并确定了MAG2复合体各成员，初步分析复合体功能，其次，AtUfe1和AtSec20共定位于内质网，AtUfe1还分布于高尔基体。第三，筛选出atufe1、atsec20突变体，并杂交筛选获得了atufe1 atsec20双重突变体，同时还制备了AtUfe1的RNAi转基因植物。通过对AtUfe1表达量的分析发现，atufe1突变体中，AtUfe1表达量有所下降，说明此突变体中AtUfe1的表达下调。在atsec20突变体中，AtUfe1表达量也有所下降，而atufe1 atsec20双重突变体中，AtUfe1表达量大幅下降，这些暗示了AtUfe1和AtSec20二者在功能上的相关性。通过对突变体的表型观察，发现突变体没有明显的形态上的差异。但是，通过储藏蛋白质性质测定，发现atufe1、atsec20突变体和AtUfe1的RNAi转基因植物均有蛋白质运输的缺陷，即储藏蛋白质的前体异常蓄积于成熟的种子中。第四，通过western和启动子活性分析确定了AtUfe1的组织特异性表达情况，发现其根中的表达量较高，花和未成熟种子次之，茎和叶的表达量较低。第五，通过酵母双杂交分析，初步确定了MAG2复合体各成员与AtUfe1和AtSec20的相互作用关系，但是还需要in vitro实验的进一步证实。另外，通过对myc-AtUfe1转基因植物进行的pull down实验，发现了新的相互作用因子-AtSly1，目前正在进行AtSly1与AtUfe1的功能相关性的分析。同时，我们总结实验结果，重复确认一些关键性的实验，同时撰写论文，一篇已经投稿，另一篇准备投稿。