大麻素受体在DEP所致精子活力降低中的作用机制研究

Sperm motility is an important indicator of semen quality and male fertility. About 19% of male infertility cases are due to low sperm motility. Nowadays, research shows that cannabinoid receptors CB1/CB2 play an important role in the regulation of sperm motility. Our previous study shows that the diethyl phthalate (DEP) exposure is negatively associated with human sperm motility. In addition, animal study shows that the expressions of cannabinoid receptors CB1 and CB2 increase significantly in sperm of DEP poisoning rat model. Based on our previous research, we hypothesize that the CB1/CB2 signaling may have been involved in the mechanism of DEP-induced sperm motility decrease.(1)This study will further validate the effects of DEP on rat sperm motility and the expressions of cannabinoid receptors CB1/CB2 by constructing rats exposure model; (2) key molecules of PI3K/Akt and ERK/P38/MAPK pathways- CB1/CB2 downstream transmembrane signal transduction pathways, should be verified, therefore the possible mechanism(s) of cannabinoid receptors could be explored. (3) Taking the advantage of our Male Reproductive Biobank, to screen the eligible specimens to verify the expression of the cannabinoid receptors in human sperm. we do believe that we will provide a new theoretical basis for environmental DEP exposure toxicity mechanism, and practical intervention strategies as well.

精子活力是衡量精液质量和男性生育力的重要指标，在男性不育患者中约19%为精子活力低下所致。最新研究表明大麻素受体CB1/CB2对精子运动功能有重要的调控作用。本项目组前期发现环境邻苯二甲酸二乙酯(DEP)暴露与男性精子活力及运动参数负相关；动物实验结果提示DEP染毒大鼠精子中大麻素受体CB1/CB2基因的表达显著升高。我们推测大麻素受体可能在DEP环境暴露导致的精子活力下降中起到了重要作用。本课题拟开展以下研究：（1）通过构建动物染毒模型及受体干预模型 ，从体内验证DEP对大鼠精子活力的影响以及大麻素受体CB1/CB2的作用；（2）检测CB1/CB2下游跨膜信号转导通路 PI3K/Akt以及ERK/P38/MAPK的关键分子，探讨大麻素受体可能的作用机制；（3）利用本室生物样本库的优势，筛选人群标本检测精子中大麻素受体的表达情况，为环境DEP暴露作用机制提供新的理论依据和可行的干预途径。

本课题的研究内容包括三个方面：1）通过构建动物染毒模型，从体内验证DBP对大鼠精子活力的影响以及大麻素受体CB1/CB2的作用；2）检测CB1/CB2下游跨膜信号转导通路PI3K/Akt以及ERK/P38/MAPK的关键分子，探讨大麻素受体可能的作用机制；3）利用本室生物样本库的优势，筛选人群标本检测精子中大麻素受体的表达情况。主要研究进展包括：1）在我室课题组建立的大学生生殖健康队列研究中，验证了环境PAEs暴露对精液质量的影响。我们发现DBP代谢产物MnBP的含量也与精子活力呈显著负相关（P=0.042*）。通过进一步将该人群MnBP的内暴露含量与文献报道对比后发现，重庆市青年男性的DBP暴露显著低于其他的西方国家，说明即使是在较低的暴露下，DBP也可能对男性生殖健康造成损害。2）建立了DBP 暴露致雄性大鼠精子活力下降的动物模型。低剂量（100mg/kg·bw DBP）组大鼠前向运动精子和精子总活力显著降低，血清雌二醇和黄体生成素水平明显下降；高剂量（500mg/kg·bw DBP）组大鼠不仅精子活力下降，还出现体重减轻，精子密度下降，睾酮水平降低，睾丸结构改变等生殖损伤效应。此外，DBP 染毒后大鼠睾丸组织中CB1蛋白质和mRNA水平都显著上调，呈现明显的剂量效应关系； ERK总蛋白质水平和mRNA表达显著增加，p38总蛋白质水平和mRNA表达均显著降低；然而低、中、高剂量组磷酸化ERK和p38基因的蛋白质水平均较对照组显著降低（P＜0.05），提示ERK和p38正常的磷酸化状态受到了抑制。3）体外模型检测大麻素受体在DBP致精子活力下降作用中可能的信号通路。建立TM4细胞DBP体外染毒模型，以 CCK-8 法评价DBP对细胞的毒性效应；以 Annexin V/PI 染色检测 DBP 对细胞凋亡的影响。证实 DBP 可诱导睾丸毒性、支持细胞的氧化应激及线粒体途径的凋亡。此外，随着染毒剂量的增加，TM4细胞中CB1表达显著增加，p38蛋白质水平显著降低；各染毒剂量组p-p38、p-ERK表达水平明显降低；高剂量组AKT和p-AKT表达水平降低。该结果与体内染毒结果一致。本研究初步阐明了DBP暴露致CB1上调，并可能通过ERK/p38MAPK信号通路来调控生精细胞的增殖分化以及睾酮的合成分泌等过程。