枯草芽胞杆菌多元重组工程系统的建立及应用

芽胞杆菌在酶制剂、氨基酸、维生素、核苷及抗病毒类药物等生物合成中具有广泛的应用，其遗传重组操作系统在各种代谢机理、信号调控等研究中起着关键作用。现有的芽胞杆菌遗传操作系统存在重组效率低、操作周期长等缺点，只能通过耗时费力的载体构建进行单个基因的改造，无法实现在染色体上多个靶基因的同时改造。因此，建立新型、高效的枯草芽胞杆菌遗传操作系统具有极其重要的研究意义。本项目以枯草芽胞杆菌模式菌株W168为研究对象，在枯草芽胞杆菌中重构噬菌体的重组体系，构建枯草芽胞杆菌多元重组底盘工程菌；利用该工程菌同时改造枯草芽胞杆菌肌苷合成代谢途径的多个相关基因，构建肌苷工程菌，最终建立一套高效的枯草芽胞杆菌多元重组工程系统。本项目的完成将突破以往单个基因同源重组体系的限制，对整个代谢网络上多个关键靶基因同时实现高效的遗传改造和修饰，为各种芽胞杆菌及革兰氏阳性细菌新型遗传操作系统的建立提供科学依据和实践基础。

芽胞杆菌在酶制剂、氨基酸、维生素、核苷酸和抗病毒类药物等生物合成中具有广泛的应用，其高效遗传操作系统的建立对大规模修饰染色体、揭示细胞代谢机理和提高重要产品生物合成效率具有重大意义。本项目以模式菌株枯草芽胞杆菌W168为研究对象，构建了一套以单链DNA为转化底物由噬菌体重组酶GP35介导的高效重组系统，获得了噬菌体重组酶介导的底盘工程菌；仅通过一次转化，实现了多个基因的同步编辑，建立了一套快速、高通量的芽胞杆菌多元重组系统；完成了枯草芽胞杆菌肌苷合成代谢途径的改造与优化，从头构建了一株遗传背景清楚的高产肌苷的基因工程菌。首先，通过分别引入多种来源的噬菌体重组酶和不同形式的外源DNA，建立了一套以单链DNA为转化底物由噬菌体重组酶GP35介导的高效重组系统，其重组频率达到0.171±0.015，比文献报道提高了100倍。通过系统发育分析发现重组酶噬菌体的宿主与枯草芽胞杆菌的亲缘关系越近，其重组酶在枯草芽胞杆菌中的重组频率越高；反之，其重组频率越低。为突破以往单次转化基因编辑数量受到限制的问题，实现染色体多个靶基因的快速高效的同步编辑，将不同长度、不同类型和不同功能的基因修饰片段在整合质粒上串联起来以提高转入到细胞内的有效DNA数量，并通过优化串联基因的数目，实现了枯草芽胞杆菌染色体上6个基因的同步编辑，建立了芽胞杆菌多元重组系统。首次发现了一个能够有效阻断肌苷分解途径的新靶点-drm基因编码的磷酸戊糖变位酶，并结合增强嘌呤合成途径、切断分支代谢途径和阻断肌苷分解代谢途径等方法对W168 的肌苷代谢网络进行改造，从头构建得到一株遗传背景清楚的、高产肌苷的基因工程菌株。此外，通过增加启动子与靶基因间的空间距离，构建了枯草芽胞杆菌高效表达系统；利用抗毒素开关控制的毒素反筛元件，在芽胞杆菌和棒杆菌等革兰氏阳性细菌中建立了高效无痕的遗传操作系统。通过本项目研究所建立的噬菌体重组系统为芽胞杆菌属的其它细菌进行遗传操作提供了一套高效的工具，对基因工程菌的构建和生理生化的研究具有重要的指导意义；重组酶活性与其宿主亲缘关系的结果也为其它细菌进行遗传改造选择合适的重组酶提供了理论指导。此外，所建立的多元重组工程突破了以往单次转化基因编辑数量受到限制的问题，能够对整个代谢网络上多基因实现快速、高效地遗传改造和修饰，为芽胞杆菌及革兰氏阳性细新型遗传操作系统的建立提供了科学依据和实践基础。