应用自身噬菌体重组蛋白建立枯草芽孢杆菌DNA同源重组系统

Bacillus subtilis is a very important industrial microorganism. Its efficient and fluent genetic manipulation methods have not been established. We developed the recombineering systems in E. coli，Photorhabdus and Xenorhabdus，which were composed of dsDNA exonuclease, ssDNA anealling protein and host exonuclease inhibitor protein from the native phages. The three-element system has shown the best efficiency and simplicity. From our unpublished protein-protein interaction data, dsDNA exonuclease facilitates the loading of its partner ssDNA annealing protein. We also observed that using dsDNA as recombineering substrate resulted much higher efficiency than using ssDNA. We have found over 70 recombination systems in Bacillus subtilis strains and their native phages using bioinformatic approaches. Some of them were tested to be capable to mediate dsDNA homologous recombination between short identical sequences (50bp). In this project, we plan to evaluate more Bacillus phage recombination systems and to optimize a methodology, which only need dsDNA and short homology arm. A robust counter-selection system will be incorporated for seamless genetic engineering at any loci for gene knockin, gene knockout and site directed mutagenesis. An efficient Bacillus recombineering system is of great interest to functional genomics research, industrial strain modifications and large DNA cloning.

枯草芽孢杆菌是非常重要的工业微生物，但是还没有高效和简便的遗传操作方法。 我们在大肠杆菌、发光杆菌和致病杆菌里开发的DNA同源重组系统包括来源于自身噬菌体的双链DNA核酸外切酶、单链DNA退火酶和宿主核酸外切酶抑制蛋白三个元素，被证明是最有效和方便的系统。我们尚未发表的数据显示由于Red-alpha和Red-beta蛋白互作，双链DNA重组效率远远高于单链DNA。通过生物信息学的方法，我们从芽孢杆菌及其噬菌体基因组中发掘出了70多种重组酶系统，并且已经证明其中一些能高效介导双链DNA较短同源序列（50bp）之间的重组。本课题拟从这些系统中筛选和组合最优重组酶系统，优化重组酶系统的工作条件，并结合反向筛选标记，开发出枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰技术，只用很短的同源臂，完成对染色体任何位点的基因敲除、敲入、点突变等操作，从而为大规模基因组功能研究、生产菌株修饰改造、大片段基因克隆等提供技术支持。

枯草芽孢杆菌是非常重要的工业微生物，建立高效和简便的遗传操作方法具有重要意义。通过本项目的实施，完成了项目预定的研究目标，建立了枯草芽孢杆菌高效遗传转化方法；并首次从枯草芽孢杆菌基因组原噬菌体区鉴定出了具有高效重组活性的新型噬菌体重组酶系统YqaJ-YqaK，YqaJ是5’-3’双链DNA核酸外切酶，YqaK是单链DNA退火蛋白，该系统能高效介导短同源臂双链DNA同源重组；基于该重组酶YqaJ-YqaK与芽胞杆菌感受态转录因子ComK的共表达，构建了一套简单、快捷、高效的芽孢杆菌重组工程系统。新建立的系统比来自已经报导的枯草芽孢杆菌噬菌体SPP1中的Gp34.1-Gp35-GP36系统的重组效率高50倍，是枯草芽孢杆菌自身重组效率的568倍。无需制备感受态细胞，无需构建敲除载体，直接采用带有50 bp同源臂的dsDNA就能一步实现对枯草芽孢杆菌中的环状质粒的修饰，采用带有100 bp同源臂的硫代磷酸化修饰的dsDNA就能一步实现基因组的编辑，将枯草芽孢杆菌中原有的基因编辑周期由3~5天缩短到了2天，极大地方便了枯草芽孢杆菌中的基因敲除、敲入等遗传操作，也为其他芽胞杆菌中重组工程体系的建立提供了重组酶资源。.在该项研究中，我们尝试应用外源宿主核酸酶recBCD代替内源宿主核酸酶AddAB，从而应用gam抑制蛋白保护外源DNA，没有取得良好效果，后续深入的研究仍旧需要以内源宿主核酸酶的抑制作为突破点。.本项目已发表SCI论文4篇。课题的开展，带动了相关研究，应用相同研究策略，我们把工作开展到农杆菌，伯克氏菌和假单胞菌等遗传修饰开发领域。